郁再洛 羅強(qiáng)

（廣西凌云縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 533199）

禽流感(Avian Influenza,AI),主要由正黏病毒科的A型流感病毒所引起的傳染病，流行范圍廣，傳播速度快，病死率高，亞型多，變異快，其中H5和H7亞型對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和人類身體健康危害嚴(yán)重，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入A類動(dòng)物疫病，我國(guó)列為一類動(dòng)物傳染病[1]。凌云縣地處廣西西北部，云貴高原東南邊緣地帶，北連樂業(yè)縣，西接田林縣，東臨河池市的鳳山、巴馬兩縣，南靠右江區(qū)?？偯娣e2053平方公里，其中40%為喀斯特山區(qū)。由于特殊的地理位置，動(dòng)物防疫基礎(chǔ)設(shè)施薄弱，防疫力量不足，活禽及產(chǎn)品流通頻繁，導(dǎo)致禽流感疫情風(fēng)險(xiǎn)加大，2017年發(fā)生人際間感染H7N9流感，發(fā)病3人，死亡2人，禽流感防控的形勢(shì)異常嚴(yán)峻。近年來，凌云縣把免疫工作作為防控禽流感的主要措施來抓，廣泛開展禽流感免疫血清學(xué)抗體監(jiān)測(cè)，旨在對(duì)免疫工作進(jìn)行客觀評(píng)估，為科學(xué)指導(dǎo)防控工作提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 樣品來源

2018年春秋季集中免疫結(jié)束后，隨機(jī)抽全縣8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)44個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)和172個(gè)農(nóng)村散養(yǎng)戶的健康家禽，共采樣831份，其中養(yǎng)殖場(chǎng)440份，占52.94%，水禽樣品226份，占31.52%。采樣家禽經(jīng)過重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗首免或二次免疫，疫苗來自政府統(tǒng)一采購(gòu)的肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司（批號(hào)01721164）、乾元浩生物股份有限公司（批號(hào)2018099）、青島易邦生物工程有限公司（批號(hào)182364500）。疫苗免疫接種方法及劑量按相關(guān)產(chǎn)品說明書規(guī)定操作。

1.2 試劑

哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的禽流感H5亞型（Re-8株）血凝抑制試驗(yàn)抗原，批號(hào)2018001、2018007；禽流感H7亞型（H7N9株）血凝抑制試驗(yàn)抗原，批號(hào)2017012、2018007。

1.3 檢測(cè)儀器

單道、多道移液器，微量振蕩器，96孔V型血疑板，離心機(jī)等。

2 檢測(cè)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)

參照國(guó)標(biāo)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》 （GB/T 18936-2003）標(biāo)準(zhǔn)，通過血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）的方法檢測(cè)H5、H7亞型抗體。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。HI效價(jià)≥4log2判斷為合格，群體合格率達(dá)70%以上達(dá)標(biāo)。

3 結(jié)果及分析

3.1 抗體合格情況

檢測(cè)結(jié)果顯示，禽流感H5亞型和H7亞型抗體總體合格率分別為83.27%、87.97%，二者的抗體效價(jià)差距不大，但H7亞型優(yōu)于H5亞型。養(yǎng)殖場(chǎng)和農(nóng)村散養(yǎng)禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為81.36%、85.42%和85.42%、90.79%，養(yǎng)殖場(chǎng)的抗體合格率比較散養(yǎng)戶略低。雞禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為85.45%、90.79%，水禽禽流感H5、H7亞型抗體合格率分別為79.38%、83.2%，說明雞的禽流感H5、H7亞型抗體合格率比水禽高。詳見表1。

表1 禽流感H5、H7亞型抗體檢測(cè)情況（單位：份、%）

表2 禽流感H5、H7亞型一免、二免抗體檢測(cè)情況表（單位：份、%）

附圖 禽流感H5、H7亞型抗體滴度分布

3.2 抗體滴度分布情況

試驗(yàn)結(jié)果表明，所檢的831個(gè)樣品中H5亞型有770份樣品檢測(cè)出抗體，占92.65%，H7亞型有782份樣品檢測(cè)出抗體，占94.1%。HI效價(jià)≥4log2以上的分別占83.27%、87.97%，且維持在較高的抗體水平狀態(tài)，群體合格率達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部70%以上的規(guī)定要求，詳見附圖。

3.3 禽流感H5、H7亞型一免、二免抗體檢測(cè)情況

查閱免疫檔案記載，所檢樣品中有337個(gè)樣品是經(jīng)過二次免疫后采集，其H5亞型和H7亞型抗體檢測(cè)合格率分別為87.83%、91.39%，通過一免禽流感H5亞型和H7亞型抗體合格率分別為80.16%、85.63%，由此可見，經(jīng)過二免后的雞或水禽其抗體水平均比一免高，詳見表2

4 小結(jié)與討論

（1）從監(jiān)測(cè)結(jié)果來看，2018年凌云縣禽流感H5、H7亞型免疫抗體合格率都比較高，免疫應(yīng)答顯著，臨床觀察接種后副反應(yīng)小，群體合格率均超過國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，說明重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗免疫原性良好，安全有效，該苗的推廣使用避免了單苗注射，降低了成本，減少家禽應(yīng)激次數(shù)，實(shí)現(xiàn)一次免疫同時(shí)防控H5和H7兩種亞型禽流感流行毒株的目的，對(duì)防控禽流感提供有效的免疫保護(hù)作用[2]。

（2）在檢測(cè)結(jié)果表明，不同免疫程序、不同飼養(yǎng)方式、不同禽類別其抗體效價(jià)有差異。凌云縣規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的抗體合格率略低于散養(yǎng)戶的主要原因是部分養(yǎng)殖場(chǎng)由場(chǎng)主自行開展，沒有配備專業(yè)技術(shù)人員，沒有按免疫程序開展二免，加上飼養(yǎng)管理水平欠缺，環(huán)境條件差易導(dǎo)致家禽營(yíng)養(yǎng)不良，影響免疫應(yīng)答。而散養(yǎng)戶家禽雖然免疫密度相對(duì)較低，但免疫由鄉(xiāng)鎮(zhèn)動(dòng)物防疫合作社統(tǒng)一進(jìn)行，技術(shù)相對(duì)成熟，且部分血清又來自于動(dòng)物防疫示范村，按示范要求均進(jìn)行了二免。同時(shí)筆者注意到，由于春秋兩防的檢測(cè)結(jié)果作為年度績(jī)效考評(píng)的依據(jù)，一些防疫員企圖通過隨意加大注射劑量和免疫次數(shù)來提高抗體合格率，相反造成免疫抑制或麻痹，其抗體水平不一定很理想。此外，凌云縣散養(yǎng)戶及養(yǎng)禽場(chǎng)的飼養(yǎng)周期均超100d，只是在春秋季集中進(jìn)行禽流感免疫，不能按規(guī)定的日齡計(jì)劃免疫，對(duì)禽流感的免疫效價(jià)和保護(hù)作用有一定的影響。

（3）本次監(jiān)測(cè)的樣品主要采集來自春秋兩防后的家禽，樣品的來源有一定的局限性，數(shù)量也相對(duì)較少，不一定完全反映抗體水平。監(jiān)測(cè)中對(duì)不同季節(jié)、不同日齡禽類、蛋禽、種禽的流感抗體水平情況，還得不到全面的掌握和了解。檢測(cè)方法僅采用血凝和血凝抑制（HA-HI），沒能采用禽流感病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法進(jìn)行定性分析，相互印證和參考。

（4）在檢測(cè)過程中，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度濕度，抗原的標(biāo)定，紅細(xì)胞的來源及濃度，血凝反應(yīng)板的光潔度，抗原與抗體、紅細(xì)胞的作用時(shí)間，待檢血清、抗原、BPS液的污染程度、凍溶次數(shù)及操作人員的熟練程度等很多因素對(duì)血凝抑制試驗(yàn)（HI）的結(jié)果有一定影響[3]，從而導(dǎo)致漏判或誤判。實(shí)驗(yàn)中對(duì)4單位病毒配比比例準(zhǔn)確性至關(guān)重要，每次試驗(yàn)一定要對(duì)4單位抗原進(jìn)行凝集性回歸試驗(yàn)，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)中筆者經(jīng)常遇到出現(xiàn)2～3孔有凝集現(xiàn)象而影響判斷，需要除去存在血清中的非特異凝集素，方法是在56℃水浴30min，加入同體積的1%雞紅細(xì)胞，混勻，室溫靜置30min，1500r/min離心8min后取上層血清進(jìn)行檢測(cè)，判斷結(jié)果時(shí)增加一個(gè)HI滴度。也有報(bào)道稱，采用待檢血清同種家禽的紅細(xì)胞，減少非特異凝集，有待于論證和探討。

5 提高禽流感免疫效果的主要技術(shù)措施

5.1 制定切實(shí)可行的免疫程序

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果、禽病的流行特點(diǎn)和飼養(yǎng)管理水平制定合理的免疫程序，生長(zhǎng)期超過70d的肉雞場(chǎng)實(shí)行兩次免疫，15～20日齡進(jìn)行第一次基礎(chǔ)免疫，間隔3周后再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。農(nóng)村散養(yǎng)家禽實(shí)施集中免疫，對(duì)超免疫期或新補(bǔ)欄家禽及時(shí)補(bǔ)免。

5.2 規(guī)范免疫技術(shù)操作

免疫時(shí)做到操作規(guī)范、程序合理、部位準(zhǔn)確、劑量充足、安全保定、消毒規(guī)范。實(shí)施免疫前了解畜禽健康狀態(tài)，對(duì)器械嚴(yán)格消毒，疫苗必須在2～8℃的條件下保存、運(yùn)輸，使用前進(jìn)行預(yù)溫，油乳劑要充分搖勻，疫苗使用時(shí)最好1h用完。

5.3 加強(qiáng)畜禽的飼養(yǎng)管理

在對(duì)家禽免疫接種時(shí)要加強(qiáng)對(duì)畜禽的飼養(yǎng)管理，保持欄舍干凈衛(wèi)生，通風(fēng)良好，均衡飼料營(yíng)養(yǎng)，投喂黃芪多糖、電解多維等提高家禽的免疫應(yīng)答，減少應(yīng)激，免疫前后盡量不使用含抗生素、磺胺類的藥物和飼料。

5.4 強(qiáng)化家禽免疫監(jiān)測(cè)效果評(píng)估工作

定期對(duì)散養(yǎng)戶、養(yǎng)殖場(chǎng)采取集中監(jiān)測(cè)、常規(guī)監(jiān)測(cè)和隨機(jī)檢測(cè)相結(jié)合的辦法，開展家禽免疫抗體效價(jià)評(píng)估，總結(jié)免疫中存在的問題和不足，提出整改措施，對(duì)未達(dá)到免疫抗體保護(hù)水平的應(yīng)及時(shí)補(bǔ)免。

5.5 提高防疫隊(duì)伍業(yè)務(wù)素質(zhì)

禽流感免疫技術(shù)性強(qiáng)，涉及面廣，工作難度大。在免疫工作開展前，要組織開展形式多樣的宣傳、技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)，提高防疫隊(duì)伍業(yè)務(wù)素質(zhì)和養(yǎng)殖者的防疫意識(shí)，規(guī)范免疫操作，落實(shí)免疫檔案制度，確保免疫工作可追溯，全面提高防疫密度和防疫質(zhì)量，建立穩(wěn)固的免疫屏障，從而有效地控制禽流感疫情的發(fā)生。