金清

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

張巍

農(nóng)業(yè)部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室，湖北武漢430064 湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430064

程磊，郭利偉

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)為睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物，是一種常見的藥食兩用經(jīng)濟作物[1]。我國蓮資源充足，利用蓮資源開發(fā)加工的產(chǎn)品主要有蓮子、藕粉、蓮飲料、蓮脯等。臨床上，荷葉、蓮房、蓮子、蓮子心、藕節(jié)等蓮類藥材均可作為藥物用來治療多種疾病[2,3]。蓮的相關研究自20世紀60年代開始，主要集中于90年代。長期以來，化學成分的研究重點主要集中在蓮子心、荷葉以及蓮房上，其中又以蓮子心、荷葉的研究較多，但相關研究都不夠系統(tǒng)深入，而作為蓮非可食部分的蓮房卻一直被視為廢棄物丟棄，利用價值不高[4～6]。對于蓮的不同藥用部位，無論是化學成分還是藥理作用，都值得進行更深入系統(tǒng)的研究，以期獲得結(jié)構(gòu)較為完整或生物活性較好的化合物，為蓮的研究提供有價值的基礎資料，同時還可解決農(nóng)業(yè)廢棄物的利用問題，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。

本研究比較了蓮不同藥用部位(蓮子心、蓮房、荷葉)對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、肺炎克雷伯菌的抑菌作用效果，以期為系統(tǒng)研究利用藥用植物蓮提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

肺炎克雷伯菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌均保藏于農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)資源與生物技術重點開放實驗室，試驗前分別進行增菌培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度為1×107CFU/mL。

1.1.2 試驗藥物的準備

蓮子心為安徽友信藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號150303；蓮房為江西順福堂中藥飲片有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號150801；荷葉為湖北聚瑞中藥飲片有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號150401。

稱取粉碎好的干蓮子心50g，加入30倍量的80%乙醇，85℃回流提取2次，每次提取30min，合并提取液，濃縮，減壓干燥，用蒸餾水稀釋至相應濃度，121℃滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取粉碎好的蓮房50g，加入30倍量的50%乙醇，85℃回流提取2次，每次提取45min，合并提取液，濃縮，減壓干燥，用蒸餾水稀釋至相應濃度，121℃滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取粉碎好的荷葉50g，加入30倍量的70%乙醇，85℃回流提取2次，每次提取30min，合并提取液，濃縮，減壓干燥，用蒸餾水稀釋至相應濃度，121℃滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蓮不同藥用部位的體外抑菌試驗

1.2.1 各藥物工作液的制備

分別精確稱取上述蓮不同藥用部位干浸膏0.2g，用蒸餾水稀釋，將藥液濃度調(diào)整為20mg/mL，115℃滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。取若干已滅菌試管，以?0支試管為一列并編號，每一列第1個試管中加入1.8mL各自菌株適宜液體培養(yǎng)基，其余試管則加入1.0mL與第1管相同的培養(yǎng)基，然后于第1試管加入各藥物200μL，混勻后取出1.0mL放入第2試管中，依次梯度稀釋直到第10管。

1.2.2 菌懸液的制備

將3種菌種接種于3mL普通肉湯培養(yǎng)基，于全溫振蕩器中(37℃、200r/min)擴大培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后在營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)劃線接種、接種擴大培養(yǎng)2次，以確保菌株的數(shù)量和活力(固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：37℃、12～24h)。試驗前，分別吸取對數(shù)生長中期的細菌培養(yǎng)液1.0mL，用二倍稀釋菌液濃度法進行細菌計數(shù)，調(diào)整菌液濃度至1×107CFU/mL備用。

1.2.3 體外抑菌作用的測定

采用平板打孔法[7]。根據(jù)文獻[8]介紹的標準判定各藥物工作液的抑菌作用：抑菌圈直徑小于10mm為低度敏感，10～15mm為中度敏感，15mm以上為高度敏感。

1.3 蓮不同藥用部位對各細菌最小抑菌濃度(MIC)的測定

各藥物工作液的制備與1.2.1相同，但以每12支試管為一列并編號，第11和第12管不做處理；菌懸液的制備方法與1.2.2相同。接著將1～11試管中加入已準備好的菌懸液(1×108CFU/mL)5μL，第11個試管為陽性對照，而第12個試管不做處理作為陰性對照。然后將試管置于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃、12～24h)靜置培養(yǎng)。12h和24h后分別在適宜的光線下觀察試管中菌液生長情況。從疑似無混濁的試管中吸取50μL菌液涂于營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)24h后觀察，以菌落數(shù)少于5個的平板對應的藥物濃度作為該藥液對相應細菌的最小抑菌濃度(MIC)。試驗重復3次。

1.4 蓮不同藥用部位的最小殺菌濃度(MBC)測定

取若干已滅菌處理的試管，每7個試管為一列，按照1.2.1中方法制備各藥物工作液，每一列第1個試管中加入的藥物終濃度為藥物對該菌株的16MIC，混勻后試管二倍稀釋操作至第5個試管，棄1.0mL培養(yǎng)基。取1.2.2中的菌懸液(1×108CFU/mL)5μL分別加入1～6管，第6個試管為陽性對照，第7個試管不做處理作為陰性對照。然后將試管置于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃、12～24h)靜置培養(yǎng)。12h和24h后分別取樣液劃線接種于各自適宜的固體培養(yǎng)基上，于37℃孵育48h。觀察有無細菌生長。從疑似無混濁的試管中吸取50μL菌液涂于營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)24h后觀察，以無菌生長的平板對應的最低濃度作為最小殺菌濃度(MBC)。試驗重復3次。

1.5 蓮不同藥用部位抑制細菌生長曲線的測定

將各菌液分別分裝于6個50mL的錐形瓶中，每個錐形瓶15mL。然后將各藥物加入其中的5個錐形瓶中，使其藥物終濃度分別為1/16MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC，對照組加入相應培養(yǎng)基。

將上述6個50mL錐形瓶置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(37℃、200r/min)培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、18、24h測量1次其光密度D600nm值，然后繪制光密度-時間曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮不同藥用部位的體外抑菌試驗結(jié)果

蓮子心提取物對3種細菌的抑菌圈直徑分別為6、6、9mm；蓮房提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為25mm，對副溶血弧菌的抑菌圈直徑為10mm；荷葉提取物對3種供試菌種的抑菌圈直徑分別為11、12和8mm(表1)。

表1 蓮不同藥用部位提取物的體外抑制3種細菌的抑菌圈直徑

2.2 蓮不同藥用部位的最小抑菌濃度(MIC)

通過試管二倍稀釋法測得的MIC結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，蓮子心提取物對副溶血弧菌的最小抑菌濃度(MIC)為15.625mg/mL；蓮房提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為15.625mg/mL，對副溶血弧菌的最小抑菌濃度(MIC)為62.5mg/mL；荷葉提取物對3種供試菌種的最小抑菌濃度(MIC)分別為62.5、125、500mg/mL。

表2 蓮子心、蓮房、荷葉提取物的最小抑菌濃度MIC和最小殺菌濃度MBC

注：“-”表示沒有抑菌作用。

2.3 蓮不同藥用部位的最小殺菌濃度(MBC)

根據(jù)2.2中的試驗結(jié)果，分別測定蓮子心提取物對副溶血弧菌的MBC，蓮房提取物對金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的MBC，荷葉提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌的MBC。結(jié)果顯示，蓮子心提取物對副溶血弧菌的MBC為其MIC的4倍，蓮房和荷葉提取物對3種供試菌的MBC基本上為其MIC的4～8倍。其中，蓮房提取物對金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的MBC分別為62.5mg/mL和500mg/mL，荷葉提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌的MBC分別為250、1000mg/mL和2000mg/mL。

如果MBC≥32MIC，則說明細菌對所試藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此本研究中3種供試菌菌株對蓮子心、蓮房和荷葉提取物均未產(chǎn)生耐藥性。

2.4 蓮不同藥用部位提取物對細菌生長的影響

2.4.1 蓮子心提取物對副溶血弧菌生長的影響

副溶血弧菌在不同濃度蓮子心提取物的作用下，其生長曲線如圖1所示。圖1結(jié)果顯示，當藥物濃度為1/16MIC、1/4MIC和1/2MIC時，蓮子心提取物對副溶血弧菌的生長幾乎不產(chǎn)生任何影響。當濃度為1MIC時，蓮子心提取物基本上能完全抑制副溶血弧菌的生長。

圖1 蓮子心提取物對副溶血弧菌的生長曲線

2.4.2 蓮房提取物對金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌生長的影響

金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌在不同濃度蓮房提取物的作用下的生長曲線分別如圖2、圖3所示。

圖2結(jié)果顯示，對于金黃色葡萄球菌，當藥物濃度為1/16MIC和1/4MIC時，蓮房提取物對金黃色葡萄球菌的生長幾乎不產(chǎn)生任何影響；當藥物濃度為1/2MIC時，蓮房提取物對金黃色葡萄球菌的生長產(chǎn)生一定的影響，但是根據(jù)其生長趨勢，隨著時間的延長，金黃色葡萄球菌在這一條件下菌體數(shù)也能如不加藥的對照組一樣；當濃度為1MIC時，蓮房提取物基本上能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

圖2 蓮房提取物對金黃色葡萄球菌的生長曲線

圖3 蓮房提取物對副溶血弧菌的生長曲線

圖3結(jié)果顯示，副溶血弧菌不受蓮房提取物對其生長影響的藥物濃度為1/16MIC、1/4MIC和1/2MIC。當藥物濃度為1MIC時，蓮房提取物基本上能完全抑制副溶血弧菌的生長。

2.4.2 荷葉提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌生長的影響

金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌在不同濃度荷葉提取物的作用下的生長曲線分別如圖4～圖6所示。

圖4結(jié)果所示，當藥物濃度為1/16MIC、1/4MIC和1/2MIC時，荷葉提取物對金黃色葡萄球菌的生長幾乎不產(chǎn)生任何影響。當藥物濃度為1/2MIC時，荷葉提取物對金黃色葡萄球菌的生長產(chǎn)生一定的影響，但是根據(jù)其生長趨勢，隨著時間的延長，金黃色葡萄球菌在這一條件下菌體數(shù)也能如不加藥的對照組一樣。當濃度為1MIC時，荷葉提取物基本上能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

圖5結(jié)果顯示，當藥物濃度為1/16MIC和1/4MIC時，荷葉提取物對肺炎克雷伯菌的生長不產(chǎn)生影響。當藥物濃度為1/2MIC時，荷葉提取物對肺炎克雷伯菌的生長產(chǎn)生一定的影響，但是根據(jù)生長趨勢，隨著時間的延長，肺炎克雷伯菌在這一條件下菌體數(shù)也能如不加藥的對照組一樣。當藥物濃度為1MIC時，荷葉提取物基本上能完全抑制肺炎克雷伯菌的生長。

圖4 荷葉提取物對金黃色葡萄球菌的生長曲線

圖5 荷葉提取物對肺炎克雷伯菌的生長曲線

圖6結(jié)果顯示，藥物濃度為1/16MIC、1/4MIC和1/2MIC時，荷葉提取物對副溶血弧菌的生長不產(chǎn)生影響。當藥物濃度為1MIC時，蓮房提取物基本上能抑制副溶血弧菌的生長。

3 討論

近年來，濫用抗生素導致的細菌耐藥性問題日益突出，嚴重影響人類的健康和動物性產(chǎn)品的安全，已成為當前和未來養(yǎng)殖業(yè)的一個頑癥[9]。而我國醫(yī)藥工作者早在20世紀50年代即開始了中藥抑菌作用與抑菌成分的研究，并發(fā)現(xiàn)許多具有抗菌作用的中藥[10]，且其藥源廣泛、價格低廉及作用靶位多，并有增強機體免疫力、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[11,12]尤其在一些慢性感染過程中和急性感染的后期使用中草藥不僅能抗菌消炎，還具有全面的調(diào)理作用，因此系統(tǒng)地研究中藥的抑菌活性，進一步開發(fā)研究新的抗菌藥物，成為越來越多學者關注的目標，這對開發(fā)和利用我國寶貴的中藥植物資源具有十分重要的意義[13]。

圖6 荷葉提取物對副溶血弧菌的生長曲線

蓮除具有觀賞價值外，對Pb2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子具有吸附作用，對凈化水體中的總磷、總氮有明顯的作用[14]。據(jù)報道，蓮子心總黃酮對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌等細菌有抑菌活性[15,16]。白秀君等[17]發(fā)現(xiàn)荷葉乙醇提取物對大腸桿菌有較強的抑制作用。本研究結(jié)果也顯示，蓮子心、蓮房、荷葉等蓮的不同藥用部位對不同細菌的生長有一定的抑制作用，尤其是對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見菌副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌的抑菌作用效果明顯，能夠為植物蓮在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用及其研究提供有價值的科學根據(jù)，同時還可解決農(nóng)業(yè)廢棄物的利用問題，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。