田新權(quán)，付小瓊，時萌，方丹，徐雙嬌，馬磊

（棉花生物學國家重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽455000）

我國棉花總產(chǎn)和單產(chǎn)均居世界前列[1]；同時我國又是棉花最大的消費國，每年仍需要從國外進口大量棉花來緩解國內(nèi)供需矛盾[2]。進口棉花存在以次充好、弄虛作假等一系列問題[3]。另外，在我國新疆地區(qū)棉花收儲過程中一直存在“轉(zhuǎn)圈棉”（紡織企業(yè)購買儲備棉后未自用而進行倒賣，特別是將儲備棉重新套包、打包冒充新棉交儲的現(xiàn)象），盜取國家財政補貼，破壞和擾亂國家棉花收儲政策的公正性。目前有很多種檢測棉纖維品質(zhì)優(yōu)劣的技術(shù)手段來保障我國棉花產(chǎn)業(yè)安全[4]，但急需建立能夠?qū)γ藁ㄔa(chǎn)地進行快速分類的方法，為進一步規(guī)范棉花交易市場提供技術(shù)支撐，通過建立以棉纖維為介質(zhì)的棉花品種純度檢測、品種以及產(chǎn)地溯源體系，對我國棉花生產(chǎn)安全具有重要意義。

品種溯源對農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)業(yè)安全具有重要影響。品種溯源可借助于品種純度及真實性鑒定，比較常見的鑒定方法主要有：小區(qū)種植鑒定法、卡那霉素法和DNA 分子標記法[5]。簡單序列重復（Simple sequence repeat，SSR）是建立在聚合酶鏈式反應 （Polymerase chain reaction，PCR）基礎(chǔ)上的DNA 分子標記。用SSR 標記鑒定作物品種純度的試驗操作簡單，檢測速度快，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復性高，成本低，且對DNA 的質(zhì)量要求不高，備受青睞?；赟SR 分子標記，一些作物已經(jīng)建立DNA 指紋圖譜，如玉米[6]、水稻[7]、棉花[8]等，利用DNA 指紋圖譜也實現(xiàn)了玉米、水稻、棉花等作物品種真實性及純度鑒定，對保證我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

棉花基因組DNA 提取是棉花SSR 分子標記最重要的步驟之一，常規(guī)應用于棉花SSR 分子標記的組織多數(shù)為幼嫩葉片、 種子等易于提取DNA 的組織。棉花纖維是胚珠外表皮單細胞經(jīng)快速突起并極性延伸而成[9]，其發(fā)育過程經(jīng)歷纖維起始期、伸長期、次生壁加厚和脫水成熟4 個過程[10]。成熟期的棉纖維含有超過90%的纖維素，細胞壁厚，且DNA 多發(fā)生降解，這些因素均增加了棉纖維DNA 提取的難度，且限制著所提取的棉纖維DNA 的數(shù)量和品質(zhì)。由于其特殊性，目前鮮有文獻報道利用棉纖維DNA 進行SSR分子標記。本研究經(jīng)優(yōu)化得到提取棉花纖維DNA 的體系，并用于提取不同發(fā)育時期的纖維和不同年份皮棉的基因組DNA，通過對所獲得的纖維DNA 進行PCR 擴增對其質(zhì)量進行驗證；并選取13 對棉花SSR 引物對魯1127、 石抗126和瑞雜816 皮棉材料進行SSR-PCR 驗證，明確棉纖維DNA 分子標記用于棉花品種純度鑒定及品種溯源的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陸地棉TM-1 （Gossypium hirsutumL.cv.TM-1）由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。2017年材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗農(nóng)場（河南省安陽縣），取開花后0 d（胚珠）和10、15、20、25、30、40 d 的纖維樣品和正常收獲的皮棉置于－80 ℃保存?zhèn)溆茫?017、2016、2014、2010、2009年TM-1 皮棉材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。魯1127、石抗126、瑞雜816 皮棉材料由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。

主要試劑：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris、EDTA、PVP-30、 吐溫20（Tween-20）、NaCl、β-巰基乙醇，均購于北京索萊寶生物科技有限公司；Taq酶、DNA Marker 均購于北京全式金生物科技有限公司；所涉及的引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

裂解液配方：Tris 100 mmol·L－1、EDTA 10 mmol·L－1、CTAB 20 g·L－1、PVP-30 20 g·L－1、Tween-20 20 g·L－1、NaCl 1 mol·L－1、β- 巰基乙醇2%（體積分數(shù)），pH 8.0。

1.2 棉花纖維DNA的提取步驟

棉花纖維DNA 提取方法參照Paterson 等建立的棉花基因組快速提取的CTAB（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨）法[11]，并適當改進，具體步驟如下：1）取200～300 mg 棉花纖維，充分剪碎并用液氮研磨。2）加入1.5 mL 細胞裂解液，充分混勻，65 ℃水浴30 min，水浴過程中顛倒離心管數(shù)次。3）加入等體積的氯仿- 異戊醇（體積比24∶1）抽提液，緩慢顛倒多次，12 000 r·min－1，4 ℃，離心10 min。4） 取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入0.6 倍體積－20 ℃預冷異丙醇，緩慢顛倒離心管直至有沉淀析出，－20 ℃靜置20 min。5）12 000 r·min－1，4 ℃，離心2 min，棄掉上清液。6）向離心管中加入600 μL 70%（體積分數(shù)）乙醇水溶液，12 000 r·min－1，4 ℃，離心2 min，棄掉上清液。7）重復步驟6。8）加入無水乙醇，12 000 r·min－1，4 ℃，離心2 min，棄掉廢液，室溫晾置2 min。9）加入40 μL 無菌水充分溶解DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA質(zhì)量的檢測

1.3.1棉花纖維DNA 凝膠電泳檢測。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測纖維DNA 的質(zhì)量，將提取的不同發(fā)育時期的纖維DNA 在1.5%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳后置于凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）下觀察，照相。

1.3.2常規(guī)PCR 引物擴增。選取棉花泛素蛋白基因GhUBI7（Ghubiquitin7）、組蛋白基因GhHis3（Ghhistone3）和蛋白延伸因子基因GhEF1（Elongation factor-1 gene） 引物對所獲得棉纖維DNA進行常規(guī)PCR 擴增，引物設(shè)計軟件為Primer Premier 5，引物序列如表1。PCR 擴增試劑為北京全式金生物科技有限公司的2×EasyTaqPCR SuperMix （AS111-01），PCR 儀器為美國伯樂PCR儀（S1000），將PCR 產(chǎn)物在1.5%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳后置于凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）下觀察，照相。

1.4 SSR-PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳

選取魯1127、石抗126 和瑞雜816 皮棉纖維DNA 作為模板，以13 對SSR 引物進行PCR 擴增，引物序列見表2。反應體系：10×Buffer（含MgCl2）2 μL，10 mmol·L－1dNTPs 0.4 μL，2.5 U·μL－1Taq酶0.2 μL，10 μmol·L－1正向引物0.25 μL，10 μmol·L－1反向引物0.25 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 15.9 μL；反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取2 μL PCR 擴增產(chǎn)物在8%（質(zhì)量分數(shù)）的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，并顯影觀察，拍照保存[12]。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primers used in PCR

表2 SSR-PCR所用SSR引物序列Table 2 Primers used in SSR-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時期的棉花纖維DNA凝膠電泳檢測

棉花纖維是胚珠外表皮細胞經(jīng)突起和極性伸長而成的單細胞。本研究選取開花后不同時間的棉花纖維作為供試樣品，提取不同發(fā)育時期的棉纖維基因組DNA，將所提取的DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，0 DPA （開花后天數(shù)，Days post anthesis）胚珠（對照組）和10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA 的纖維DNA 均可呈現(xiàn)出單一、 清晰的DNA 條帶；且對照組0 DPA 胚珠基因組DNA 條帶最亮，25 DPA 的纖維DNA 條帶微弱，而30 DPA、40 DPA 的纖維DNA 和皮棉的纖維DNA 未呈現(xiàn)出DNA 條帶 （圖1）。利用Thermo NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測30 DPA、40 DPA 的纖維DNA 和皮棉的纖維DNA 濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些時期的材料所提取的DNA 濃度很低（表3），這也可能是進行瓊脂糖凝膠電泳未檢測出DNA 條帶的原因。

圖1 棉纖維基因組DNA的瓊脂糖電泳圖譜Fig.1 The agarose gel electrophoresis pattern of fiber genomic DNA

2.2 不同發(fā)育時期的棉花纖維DNA的PCR擴增

隨著棉花纖維的發(fā)育，所提取的DNA 含量也在降低。為了明確纖維發(fā)育后期低含量的DNA 能否用于常規(guī)PCR 擴增中，本研究選取了棉花泛素蛋白基因GhUBI7、組蛋白基因GhHis3和蛋白延伸因子基因GhEF1 引物對所獲得的不同發(fā)育時期的棉纖維DNA 進行PCR 擴增，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，不同時期的纖維DNA 均可擴增出清晰的目的基因條帶（圖2）。這一定程度上表明提取的不同時期的纖維DNA 能滿足常規(guī)的PCR 擴增，可用于后續(xù)系列分子生物學的研究。

表3 DNA樣品純度與濃度檢測結(jié)果Table 3 The result of inspection on purity and concentration of DNA

圖2 對不同發(fā)育時期的棉纖維DNA的擴增結(jié)果Fig.2 The amplification results of cotton fiber DNA at different developmental stages

2.3 不同年份皮棉D(zhuǎn)NA的PCR擴增

本研究選取了不同年份（2017、2016、2014、2010、2009年）采摘的成熟棉纖維（室溫儲存）作為供試樣品，同批次提取基因組DNA，以所獲得的DNA 作為模板，以棉花GhHis3、GhUBI7、GhEF1 基因引物對所獲得DNA 進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，不同基因均可擴增出清晰的條帶（圖3），說明所提取的不同年份皮棉D(zhuǎn)NA 的質(zhì)量可滿足常規(guī)PCR 擴增要求。

2.4 棉纖維DNA的SSR-PCR擴增

用13 對SSR 引物對參加2016年棉花區(qū)試的魯1127、 石抗126 和瑞雜816 皮棉D(zhuǎn)NA 進行PCR 擴增，結(jié)果顯示不同的SSR 引物均能擴增出DNA 條帶，且?guī)颓逦⑼暾▓D4）。說明此DNA提取法提取的DNA 完全能滿足于SSR-PCR 擴增，使基于棉纖維DNA 的SSR 標記檢測品種純度成為可能，也進一步為根據(jù)棉纖維DNA 區(qū)分棉花品種、產(chǎn)地提供了技術(shù)支持。

圖3 對不同年份皮棉的DNA的擴增結(jié)果Fig.3 The amplification results of DNA from ginned cotton in different years

3 討論

本研究嘗試對不同發(fā)育時期棉纖維DNA 進行提取，凝膠電泳結(jié)果顯示發(fā)育后期纖維中提取的DNA 含量很低，不能顯示出DNA 條帶。這一方面可能是由于棉纖維細胞壁厚難裂解，另一方面可能是由于核酸物質(zhì)多數(shù)集中在種殼端，且隨著纖維成熟，核酸物質(zhì)降解，發(fā)育后期纖維樣品中的DNA 含量少。雖然提取的DNA 質(zhì)量和數(shù)量較低，但是對提取的低濃度纖維DNA 進行PCR和SSR-PCR 擴增發(fā)現(xiàn)，均能擴增出清晰、明亮的DNA 條帶，這說明利用該提取法提取棉纖維DNA 是可行的。

SSR 分子標記，已被廣泛應用于農(nóng)作物品種純度鑒定，如水稻[13]、玉米[14]、小麥[15]、棉花[16]、大豆[17]等?；谶@種技術(shù)手段，棉花品種鑒定取得很大進展：武耀廷等[18]利用SSR 分子標記檢測了30 個陸地棉栽培品種和4 個高優(yōu)勢雜交種親本的多態(tài)性，建立了雜交種的SSR 指紋圖譜，用于分子鑒定和純度檢測。張小娟等[16]利用39 對SSR引物對16 個不同來源的棉花品種進行了區(qū)別與鑒定。棉纖維DNA 的提取為棉花品種純度及真實性鑒定提供了一種檢測途徑。

如何通過檢測棉纖維來區(qū)分其原產(chǎn)地是科研人員所關(guān)注的，國內(nèi)外常見的產(chǎn)地溯源技術(shù)有：礦物元素指紋分析技術(shù)、有機成分指紋分析技術(shù)、近紅外光譜指紋分析技術(shù)、電子鼻技術(shù)和DNA 指紋技術(shù)[19-20]。美國研究人員借助近紅外光譜技術(shù)對來自印度、中國、巴基斯坦、美國等國家棉花纖維進行初步檢測分析，目的是通過一些參數(shù)來區(qū)分美國本土棉和進口棉，避免進口棉花冒充本土棉花[21]?；贒NA 指紋技術(shù)來鑒定產(chǎn)地溯源的報道相對較少，現(xiàn)有研究主要依賴于對自身DNA 指紋圖譜和寄生微生物菌落的DNA 指紋圖譜進行分析[22-23]。本研究所探索的棉纖維DNA提取方法，為下一步以棉纖維DNA 作為介質(zhì)，利用其遺傳信息來區(qū)分棉花原產(chǎn)地奠定了基礎(chǔ)；可為區(qū)分國產(chǎn)棉與進口棉提供技術(shù)手段，對保障我國棉花產(chǎn)業(yè)安全具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究提取了不同發(fā)育時期棉纖維的基因組DNA。隨著纖維發(fā)育，DNA 提取的難度也在加大；成熟棉纖維中提取的DNA 含量較低，但不影響PCR 擴增，可滿足SSR 分子標記需要。本研究證實了棉纖維DNA 用于棉花品種純度及品種溯源的可行性。