宋雯，王春巧，俞燕，高峰，黃家風

（石河子大學農學院/ 新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆石河子832003）

棉花黃萎病對棉花生產造成嚴重危害，在發(fā)病嚴重的地區(qū)可造成棉花減產30%以上，是影響中國棉花生產的主要病害之一[1]。在中國，該病是由土傳真菌大麗輪枝菌 （Verticillium dahliaeKleb.）引起的維管束病害。棉花黃萎病菌產生的微菌核抗逆性強，可在土壤中存活10年以上[2]，常年連作導致棉花黃萎病發(fā)生日趨嚴重；由于缺乏有效的防治藥劑和抗病品種，該病害防治已是生產上的重要難題。因此，盡快從分子水平深入解析大麗輪枝菌的致病機制，找到調控致病機制中的關鍵因子，對棉花抗病分子育種和探索新型防治方法具有重要的理論價值。

近年有關大麗輪枝菌功能基因組研究取得了較大發(fā)展，有些基因是大麗輪枝菌致病所必需的基因，如噻唑合成基因VdThi4[3]、維生素B1 運輸基因VdThit[4]、內切葡聚糖酶基因VdEG-1[5]和與侵染釘形成相關的基因VdNoxB、VdPls1[6]，它們的敲除均使大麗輪枝菌喪失致病力。有些基因雖然不是致病所必需的基因，但是將其敲除后明顯減弱大麗輪枝菌的致病力，如葡萄糖阻遏蛋白基因VdCYC8[7]、編碼富含谷氨酸蛋白的基因VdGARP1[8]、蔗糖非發(fā)酵激酶基因VdSNF1[9]和尿嘧啶DNA 糖基化酶基因VdUDG[10]。有些基因編碼效應子蛋白通過影響植物免疫參與致病，如Ave1 基因編碼的蛋白誘導含Ve1 基因的番茄產生抗性，在不含Ve1 基因的番茄上卻是主要的致病因子[11]；效應蛋白Vdlsc1 通過干擾寄主植物的水楊酸代謝，抑制水楊酸介導的防衛(wèi)反應，協(xié)助病原菌侵染寄主[12]；VdNLP1、VdNLP2[13-14]和Vd-CUT11[15]基因編碼的蛋白誘導植物免疫引起細胞死亡。有些基因通過信號途徑參與大麗輪枝菌致病，如絲裂原活化蛋白激酶基因VMK1[16]、跨膜粘蛋白基因VdMSb[17]、高滲透激活蛋白激酶基因VdHog1[18]和編碼產物具有4 個跨膜功能域的VdSho1 基因[19]通過絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信號途徑影響大麗輪枝菌致??；VdPKAC1 和VGB基因分別通過環(huán)腺苷酸 （Cyclic adenosine monophosphate，cAMP） 依賴信號途徑和G 蛋白信號途徑對大麗輪枝菌的致病力起正向調控作用[20-21]；聚酮合酶基因VdPKS1 通過黑色素合成途徑影響致病[22]。還有一些基因通過編碼轉錄因子參與大麗輪枝菌的致病過程，如VdSge1 基因編碼的轉錄調節(jié)因子不僅調節(jié)其他效應子基因的表達，而且是大麗輪枝菌產孢和致病所必需的因素[23-24]；轉錄因子基因Vdpf[25]、VdMcm1[26]、VdCrz1[27]和VdFTF1[28]，除了對大麗輪枝菌的毒力起正向調控作用外，還分別參與調控微菌核形成、黑色素合成相關基因和植物細胞壁降解酶基因的表達。綜上所述，大麗輪枝菌的致病機制復雜，所有這些基因在真菌發(fā)育和致病過程中的相互作用仍有待深入研究。

多胺包括腐胺、亞精胺（Spermidine，Spd）和精胺，是廣泛存在于細胞內的低分子量、聚陽離子、具有生物活性的脂肪族含氮堿，在基因表達、胚胎發(fā)育、細胞分化以及響應非生物脅迫等方面有重要作用[29]。細胞內多胺水平的穩(wěn)定主要受鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）和鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白（Ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）嚴格調控[30]。ODC 是以磷酸吡哆醛為輔基的氨基酸脫羧酶，是多胺合成途徑中的第1 個限速酶，催化L-鳥氨酸脫羧生成腐胺，腐胺再經過一些催化作用生成精脒和精胺[31]。它對多胺的合成起極其重要的作用。OAZ 在翻譯后可以連接到ODC 上，抑制ODC 的催化活性，并靶向地促使26S 蛋白酶降解ODC，從而負向調控細胞內的多胺含量[32]。OAZ 都具有保守的ODC-AZ結構域，將編碼這類蛋白的同源基因命名為OAZ基因。OAZ基因具有2 個開放閱讀框（ORF1 和ORF2），ORF2 的表達以核糖體移碼的翻譯機制翻譯蛋白，當細胞中存在過高濃度的多胺時，誘導核糖體＋1 移碼，跳過ORF1 終止子中的T 堿基，繼續(xù)翻譯，表達具有抗酶蛋白功能的OAZ，OAZ 又反過來降低胞內多胺的濃度，從而使細胞內的多胺濃度維持在穩(wěn)定水平[33]。

本實驗室前期研究發(fā)現，利用棉花根系分泌物誘導培養(yǎng)導致棉花黃萎病菌鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白基因（VdOAZ）明顯上調表達。因此，本研究將該基因從大麗輪枝菌野生型菌株V592 中敲除，通過生物學特性和致病力測定及致病相關的其他基因在敲除突變體和V592 中的表達分析，以及Spd 誘導條件下，測定V592 菌株中VdOAZ基因及致病相關的其他基因的相對表達量，初步明確VdOAZ基因對大麗輪枝菌的毒力、 微菌核的形成及分生孢子產生的影響，并能響應Spd 水平的變化。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及載體

本研究所用的大麗輪枝菌野生型菌株V592[8]來自于棉花，屬于落葉型強致病力菌株，由本實驗室分離、鑒定并保存?？寺≥d體pMD19-T 購自寶生物TaKaRa 公司。敲除載體pGKO-HPT 由郭惠珊研究員惠贈，該載體攜帶單純皰疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase）基因HSVtk作為負向篩選標記。用于基因互補的載體p1300-Neo-oLiC-Cas9-TtrpC，包括oLiC 啟動子和TtrpC 終止子，由本實驗室構建并保存。

1.2 VdOAZ 基因的克隆及測序

將V592 菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA 培養(yǎng)基）上活化并培養(yǎng)菌株7 d，并按照Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux）提取試劑盒說明書的方法提取菌株DNA。將V592 菌株在Czapek-Dox 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心并收集沉淀，按照Trizol（QIAGEN）法分別提取菌株的總RNA。并用PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ（TaKaRa）進行cDNA 合成。根據美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 中公布的大麗輪枝菌全基因組（V.dahliaeVdLs.17）數據庫的基因信息，檢索到OAZ基因VDAG_00022 的序列，根據該序列設計引物VdOAZfull-F （5'-ATGTCGCCCATGAAAAACAACAATAATC-3'） 和VdOAZfull-R（5'-CTACAGCTCCATGCCCATGAA G-3'）。分別從V592 菌株的基因組DNA 和cDNA 中經聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增OAZ基因的全長，克隆測序并命名為VdOAZ。

1.3 載體構建和真菌轉化

利用基因同源重組原理，用潮霉素抗性基因（HPH）取代VdOAZ基因的1 006 bp 片段。使用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 高保真DNA 聚合酶 （TsingKe） 進行PCR 擴增，先用引物VdOAZ-up-F（5'-CTTGCTGAGGTCTTAATTAAGGGTCATGTCACTCCGT-3'） 和VdOAZ-up-R（5'-AGTGCTGAGGCATTAATTAATTCATTTTCCATTCGTCCCA-3'） 從V592 基因組中擴增VdOAZ基因上游842 bp 的DNA 片段；再用引物VdOAZ-down-F（5'-CCCGCTGAGGACTTAATTAATTCCTGGGGGTCGAGTT-3'）和VdOAZ-down-R（5'-CTCGCTGAGGGTTTAATTAACGTGGCAATTACCTACACA-3'） 從V592 基因組中擴增VdOAZ基因下游793 bp 的DNA 片段。用PacⅠ限制性核酸內切酶將載體pGKO-HPT 酶切線性化，將目標基因的2 個同源臂和線性化載體通過ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme）進行重組，構建敲除載體pGKO-HPT∷VdOAZ。將構建成功的敲除載體通過農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法轉化V592 菌株的分生孢子。轉化子的篩選先用Wang 等[34]的PCR 方法進行初步篩選，再分別用檢測HPH基因的引物Hph588U （5'-AGCTGCGCCGATG-GTTTCTACAA-3'）和Hph588L（5'-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3'）和檢測VdOAZ基因的引物VdOAZfull-F、VdOAZfull-R 對轉化子進行二次篩選，目標基因VdOAZ被HPH基因取代的轉化子（敲除突變體）只能擴增到HPH基因片段，不能擴增到VdOAZ基因的目標條帶。

為了構建VdOAZ基因的互補載體，用引物inEC-OAZ-F（5'-ACAATCGATCCAACCTCTAGAATGTCGCCCATGAAAAACAACA-3'）和inECOAZ-R（5'-TTAAGTGCGGCCGCTGGATCCCTACAGCTCCATGCCCATGAA-3'）從野生型V592基因組DNA 中擴增VdOAZ基因全長。然后該將基因全長連接到用XbaⅠ/BamHⅠ酶切線性化的p1300-Neo-oLiC-Cas9-TtrpC 載體中。然后通過ATMT 方法將該載體轉化至VdOAZ基因的敲除突變體中。轉化子通過G418 抗生素和PCR 方法進行篩選。最后，使用引物VdOAZ-qPCR-F （ 5'-CCTGGCTCGAGATCTGGGATTT-3'）和VdOAZ-qPCR-R（5'-AACGTTGCCATCGAAGAATACGAACA-3'），通過實時熒光定量逆轉錄PCR（Reverse transcription-quantitative real time PCR，RT-qPCR）對目標基因VdOAZ在野生型菌株、 敲除突變體菌株和互補菌株中的轉錄水平進行測定，對目標基因的敲除和互補進行再次確定。

1.4 RT-qPCR分析

VdOAZ基因在野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體和互補菌株中的轉錄水平，大麗輪枝菌VdPKAC1（VDAG_06474.1）[20]、VMK1（VDAG_09461.1）[16]、VdNLP1（VDAG_04701.1）[14]、VdNLP2（VDAG_01995.1）[14]、VdCYC8（VDAG_07052）[7]、VGB（JQ665433.1）[21]、VdSge1（VDAG_06298.1）[23-24]、VdHog1（VDAG_08982）[18]、VDH1（VDAG_02273.1）[35]基因在野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體和互補菌株中的轉錄水平，以及在1 mmol·L－1Spd 誘導4 h 后VdOAZ、VdPKAC1[20]、VMK1[16]、VdNLP1[14]、VdNLP2[14]、VdSge1[23-24]、VDH1[35]基因在野生型菌株V592 中的轉錄水平，均通過RT-qPCR 進行測定。根據方法1.2，提取各菌株的總RNA，并合成cDNA，然后按照PowerUp SYBR Green Master Mix（Life Technologies）試劑盒說明添加樣品，PCR 反應在7500 Real Time PCR System（Life Technologies）中進行。針對不同基因設計相應的特異性引物（表1），以β-tubulin基因（DQ266153）作為內參基因。每個反應設3 個重復。試驗數據采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

表1 供試引物Table 1 Primers used in this study

1.5 真菌表型特征的測定

菌落生長速率的測定：以野生型菌株V592為對照，取直徑5 mm 的菌塊接種于PDA 培養(yǎng)基中央，26 ℃黑暗培養(yǎng)。接種后的第5 天和第15天，分別測量每個菌株的菌落直徑，計算菌落的平均生長速率；并在接種后第15 天，拍照記錄菌落形態(tài)，每個菌株設5 個重復。

產孢量的測定：以野生型菌株V592 為對照，將1 mL 含量為1.0×106mL－1的分生孢子懸浮液加入到100 mL Czapek-Dox 液體培養(yǎng)基中，26 ℃、200 r·min－1培養(yǎng)7 d，以24 h 的間隔計數分生孢子的數量，每個菌株設6 個重復。

微菌核量的測定：以野生型菌株V592 為對照，在PDA 培養(yǎng)基上鋪1 層玻璃紙，取300 μL含量為1.0×107mL－1的分生孢子懸浮液涂布在玻璃紙上，26 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，觀察微菌核形成情況[8]；將玻璃紙上的微菌核刮下，置于稱量紙上稱量，得到微菌核的鮮質量；然后將其室溫下靜置48 h，稱量干質量。每個菌株設置3 個重復。

1.6 致病力測定

選取棉花感病品種“軍棉1 號”用于致病力測定。將棉苗在MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至3～4片真葉展開時采用無傷浸根接種法進行接種[8]，分別以野生型菌株V592 和無菌水為陽性和陰性對照。病害分為4 個等級：1%～25%的葉片表現萎蔫癥狀為1 級，26%～50%的葉片表現萎蔫癥狀為2 級，51%～75%的葉片表現萎蔫癥狀為3級，76%～100%的葉片表現萎蔫癥狀為4 級。病情指數（DI）的計算公式＝[Σ（各病級株數×相應病級）/ 調查總株數×最高病級（4）]×100。植株發(fā)病后每2 d 統(tǒng)計1 次病情指數，每個菌株接種3 個營養(yǎng)缽，每個營養(yǎng)缽12 棵棉苗。

1.7 感病棉株中真菌生物量測定

為了明確VdOAZ基因對大麗輪枝菌侵染及定植能力的影響，對接種了野生型菌株V592、VdOAZ基因敲除突變體和互補菌株的棉株，通過qPCR 進行真菌生物量測定。接種后26 d，取棉花的根（紅莖線以下取根5 cm）、莖（棉苗一半株高處取莖5 cm）、葉，分別提取根、莖、葉的總DNA。qPCR 所用引物 [轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）-F（5'-TGTTGCTTCGGCGGCTCGTT-3'）和ITS-R（5'-GCGTTTCGCTGCGTTCTTCA-3'）] 是基于大麗輪枝菌核糖體RNA（Z29511）的ITS1 和ITS2 區(qū)設計的。以組成型表達的β-tubulin基因（DQ266153）作為內參基因，對每個樣品的總DNA 進行標準化定量。每個反應設3 個重復。

2 結果與分析

2.1 VdOAZ 基因的克隆與序列分析

通過克隆測序得到VdOAZ基因全長為1 006 bp，預測編碼蛋白的cDNA 序列為798 bp。對2 次測序結果進行序列分析，結果表明VdOAZ基因由3 個外顯子和2 個內含子組成，外顯子分別位于9～161、268～704 和799～1 006位核苷酸，內含子分別位于162～267 位核苷酸和705～798 位核苷酸。VdOAZ基因通過2 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼蛋白，ORF1 長度為312 bp，編碼103 個氨基酸殘基；ORF2 長度為798 bp，通過核糖體在第425 位T堿基＋1 移碼形成，編碼的蛋白含有265 個氨基酸，具有OAZ 所特有的ODC-AZ 保守結構域，因此只有ORF2 才編碼形成VdOAZ 蛋白。VdOAZ基因與大麗輪枝菌 VdLs.17 的VDAG_00022 基因核苷酸序列相似性為97.9%，VdOAZ 蛋白與大麗輪枝菌 VdLs.17 中VDAG_00022 所編碼的氨基酸序列相似性為98.1%，與其他真菌OAZ 也具有一定的氨基酸序列相似性，與堿菌（Sodiomyces alkalinus）的序列相似性為48.0%，與鐮刀菌（Fusarium langsethiae）的序列相似性為43.5%。

2.2 VdOAZ 基因的敲除與互補驗證結果

利用基因同源重組原理構建了針對VdOAZ基因的敲除載體（圖1-A），通過ATMT 法轉化大麗輪枝菌分生孢子和PCR 篩選[34]，將獲得的同源重組轉化子，再分別用HPH基因和VdOAZ基因的特異性引物進行二次篩選，結果如圖1-B 所示，3 個VdOAZ敲除突變體（vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3） 都能擴增到588 bp 的HPH基因片段，不能擴增到1 006 bp 的VdOAZ基因片段；而野生型菌株V592 只能擴增到預期大小的VdOAZ基因片段。將完整的VdOAZ基因片段轉化敲除突變體vdoaz-1，PCR 檢測結果（圖1-B）顯示，2個互補菌株（EC-oaz-1 和EC-oaz-2）均能擴增到預期大小的VdOAZ基因片段。

通過RT-qPCR 對VdOAZ基因在野生型菌株V592、 敲除突變體和互補菌株的表達進行分析，結果（圖1-C）顯示，VdOAZ基因在vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 中幾乎不表達，而在互補體菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 中的表達明顯恢復到V592 水平，分別達到V592 表達量的102.9%和97.22%。表明VdOAZ基因在vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 中被成功敲除，在互補菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 中得到互補。

圖1 棉花黃萎病菌VdOAZ基因的敲除Fig.1 Deletion of the VdOAZ gene in V.dahliae isolated from cotton

2.3 VdOAZ 基因敲除突變體菌落形態(tài)與生長速率

培養(yǎng)性狀觀察結果顯示，3 個VdOAZ敲除突變體的菌落形態(tài)與野生型菌株V592 和互補菌株的菌落形態(tài)沒有明顯差異，都形成菌核型菌落（圖2），但是3 個VdOAZ敲除突變體的菌落生長速率顯著低于V592 和互補菌株（圖2，表2），表明VdOAZ基因敲除導致大麗輪枝菌生長減慢。

圖2 野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體及互補菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Fig.2 Phenotypic characteristics of the wild type strain V592, VdOAZ gene deletion mutants and complementary strains on PDA medium

表2 VdOAZ 敲除突變體在PDA 培養(yǎng)基上的菌落生長速率Table 2 Colony growth rate of VdOAZ gene deletion mutants on PDA medium

2.4 VdOAZ 敲除突變體的微菌核產量

圖3-A 顯示，接種14 d 后，3 個VdOAZ敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 形成的黑色微菌核明顯少于野生型菌株V592 和2 個互補菌株。微菌核鮮質量和干質量結果也顯示，3 個VdOAZ敲除突變體形成的微菌核質量極顯著低于V592和2 個互補菌株（圖3-B）。上述結果表明，VdOAZ基因不是大麗輪枝菌微菌核形成所必需的基因，但是VdOAZ基因敲除明顯影響大麗輪枝菌微菌核的產量。

2.5 VdOAZ 敲除突變體的產孢量

產孢量測定結果表明，與野生型菌株V592、互補菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 相比，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 的產孢量顯著減少（圖4）。在接種第7 天時，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 的產孢量僅為 V592 的40.76%、45.65%和57.07%，互補菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 的產孢量可達到V592 的92.93%和89.67%。結果表明，VdOAZ基因參與分生孢子的產生。

2.6 VdOAZ 敲除突變體的致病力

分別用野生型菌株V592，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2、vdoaz-3 和互補菌株EC-oaz-1、EC-oaz-2 接種棉花感病品種“軍棉1 號”，接種后10 d 時，所有棉花植株開始表現萎蔫癥狀，表明VdOAZ基因敲除不會對棉花黃萎病的發(fā)病有延遲作用。接種后26 d 時，V592 導致感病棉花葉片萎蔫、脫落，甚至全株枯死，病情指數達到94.3；而3 個敲除突變體在感病棉花上引起的病害癥狀明顯減輕，病情指數分別為65.0、68.7 和63.3；2 個互補菌株對棉花的致病力得到恢復，病情指數分別為90.0 和87.3 （圖5-A 和5-B）；表明VdOAZ基因敲除導致大麗輪枝菌致病力下降。

接種26 d 后，對植株內的真菌生物量進行測定，結果顯示，在根組織中，3 個敲除突變體的真菌生物量顯著高于野生型菌株V592 和2 個互補菌株（圖5-C）；而在莖組織中，3 個敲除突變體的真菌生物量又顯著低于V592 和2 個互補菌株，表明VdOAZ基因敲除導致大麗輪枝菌在寄主體內的擴展受阻。

2.7 致病相關的其他基因在VdOAZ敲除突變體中的表達

如圖6 所示，與野生型菌株V592 相比，VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1 在3個敲除突變體中的相對表達量顯著上調，分別是V592 菌株表達量的15.4 倍、14.7 倍、4.5 倍、3.4 倍和6.9 倍；1 個基因（VDH1）在3 個敲除突變體中的相對表達量顯著低于V592 中的表達量；3 個基因（VdCYC8、VGB和VdHog1）在3 個敲除突變體中的相對表達量與V592 沒有顯著差異。由于這些上調或下調表達的基因與大麗輪枝菌的孢子產生、微菌核形成及毒力相關，表明VdOAZ基因在參與大麗輪枝菌的孢子產生、 微菌核形成及致病過程中與這些基因有不同的相互作用。

圖3 VdOAZ基因敲除體的微菌核產量Fig.3 Microsclerotia production of VdOAZ gene deletion mutants

圖4 VdOAZ基因敲除突變體產孢量的測定結果Fig.4 Conidia production of VdOAZ gene deletion mutants

圖5 VdOAZ基因敲除突變體對棉花致病力與病株真菌生物量的測定結果Fig.5 Disease severity and fungal biomass in cotton plants infected by the VdOAZ gene deletion mutants

圖6 大麗輪枝菌其他致病基因在VdOAZ基因敲除突變體中的相對表達量Fig.6 Relative expression of other genes involved in virulence in V.dahliae in VdOAZ gene deletion mutants

2.8 亞精胺誘導后VdOAZ基因及致病相關的其他基因的表達量

以不被誘導的野生型菌株V592 為對照，上述各基因在Spd 誘導4 h 后的表達情況如圖7 所示。V592 經Spd 誘導培養(yǎng)后，VdOAZ基因的相對表達量顯著上調了2.6 倍，VDH1 基因的相對表達量有所上調但不顯著，而VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2、VdSge1 的相對表達量明顯下調。表明VdOAZ基因對多胺水平的變化是有響應的；VdOAZ基因對VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1 的表達具有負調控作用，VdOAZ基因及其負調控基因均能響應多胺水平的變化。

圖7 亞精胺誘導4h后VdOAZ和大麗輪枝菌致病相關的其他基因在V592中的相對表達Fig.7 Relative expression of VdOAZ gene and other genes involved in virulence of V.dahliae in V592 induced by spermidine for 4 h

3 討論

生物體中，當細胞中多胺濃度過高時，為了穩(wěn)定細胞中多胺水平，OAZ 起負向調控細胞內多胺含量的作用[32]。本研究從棉花黃萎病菌中通過克隆測序得到VdOAZ基因全長，序列分析表明，VdOAZ基因在425～427 位核苷酸有1 個TGA終止密碼子，ORF2 的編碼只有通過核糖體在425 位T 堿基＋1 移碼才可以繼續(xù)翻譯蛋白，且只有通過移碼翻譯的蛋白才具有真核生物OAZ所特有的ODC-AZ 保守結構域，表明ORF2 編碼的VdOAZ 蛋白在大麗輪枝菌中可能具有鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白的功能。本研究將V592 菌株經Spd 誘導培養(yǎng)4 h，VdOAZ基因的表達量顯著上調，表明VdOAZ基因能對多胺水平變化做出響應，間接證明VdOAZ 蛋白具有鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白的功能。然而萵苣大麗輪枝菌VdLs.17 的同源基因（VDAG_00022）在相同位點不存在終止子，暗示這種移碼機制可能只在部分大麗輪枝菌中存在。這需要對不同來源的大麗輪枝菌進行大量測序才能確定。由于目前有關OAZ 的研究主要集中在哺乳動物細胞中，OAZ 在真菌體內是否可以調節(jié)多胺水平以及調節(jié)機制是否與哺乳動物細胞內的機制一致也需進一步研究。

VdOAZ基因對棉花黃萎病菌生長發(fā)育的影響結果表明，VdOAZ基因敲除導致棉花黃萎病菌的菌落生長速率降低、產孢量及微菌核產量下降。通過RT-qPCR 對其他基因在VdOAZ敲除突變體中的轉錄水平進行測定，VDH1 基因的轉錄水平明顯下調，由于VDH1 基因敲除導致大麗輪枝菌微菌核形成受阻[35]，表明VdOAZ基因在VDH1 基因影響微菌核形成的途徑中具有正向調控作用。VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2和VdSge1 在VdOAZ敲除突變體中的轉錄水平明顯上調，當VdOAZ基因受Spd 誘導表達后，這5 個基因的表達又顯著下調，表明VdOAZ基因對這5 個基因的表達具有負調控作用；其中2 個基因VdPKAC1 和VMK1 與大麗輪枝菌的微菌核形成和孢子產生相關，VdPKAC1 基因敲除后，其突變體微菌核產量增加、產孢量減少[20]，VMK1基因敲除的突變體微菌核形成和產孢量均減少[16]。由于VdPKAC1[20]和VMK1[16]基因分別是cAMP信號途徑和MAPK 信息素調控途徑的關鍵基因，因此VdOAZ基因可能通過這2 個信號途徑參與微菌核和分生孢子的形成過程。另外，VdNLP1[13]和VdSge1[24]也與大麗輪枝菌的孢子產生有關，它們的敲除突變體產孢量均明顯低于各自的野生型菌株。因此，VdOAZ基因參與大麗輪枝菌的孢子產生過程可能與這2 個基因也有關。

VdOAZ基因敲除導致棉花黃萎病菌致病力顯著降低。qPCR 結果表明，VdOAZ敲除突變體在棉花根中的生物量顯著高于野生型菌株，但在棉花莖中的生物量卻顯著低于野生型菌株，表明VdOAZ基因敲除導致大麗輪枝菌由根向莖的擴展受到阻礙，因此推測VdOAZ敲除突變體致病力下降的原因可能與其擴展受阻及莖中的生物量下降有關。另外，在VdOAZ敲除突變體中，轉錄水平表現明顯上調的5 個基因（VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1） 和轉錄水平表現下調的1 個基因（VDH1）除了與孢子產生和微菌核形成相關外，均是大麗輪枝菌致病相關基因，其中VdSge1 基因敲除導致大麗輪枝菌致病力喪失[23-24]，VdPKAC1[20]、VMK1[16]、VdNLP1 和VdNLP2[14]基因敲除導致大麗輪枝菌致病力減弱，表明VdOAZ基因參與的是1 個復雜的調控網絡，其中包括cAMP 信號途徑、MAPK 信息素調控途徑及轉錄因子調控途徑。VdOAZ基因與這些途徑和基因共同調節(jié)了大麗輪枝菌的產孢、微菌核形成及致病過程，但是這些基因在復雜的調控網絡中的相互作用機制還有待深入研究。

已有研究表明，G 蛋白和cAMP 信號途徑是相互偶聯(lián)的，共同調控大麗輪枝菌孢子產生、微菌核形成和致病過程[21]。本研究發(fā)現，在VdOAZ敲除突變體中，VdPKAC1 基因[20]的轉錄水平顯著上調，VGB基因[21]的轉錄水平不受影響，表明VdOAZ基因通過負調控VdPKAC1 基因的表達參與cAMP 信號傳導，但不參與G 蛋白信號傳導途徑。同樣地，基因VMK1[16]和VdHog1[18]分別是MAPK 信息素調控途徑和MAPK 高滲調節(jié)途徑的關鍵基因，在VdOAZ基因敲除突變體中，VMK1 基因的轉錄水平明顯上調，而VdHog1 基因的轉錄水平不受影響，表明VdOAZ基因通過負調控VMK1 基因的表達參與MAPK 信息素信號途徑，但不參與以VdHog1 為中心的MAPK 高滲調節(jié)途徑。

4 結論

從棉花黃萎病菌落葉型強致病力菌株中克隆到VdOAZ基因全長，其ORF2 編碼的VdOAZ蛋白具有OAZ 所特有的ODC-AZ 保守結構域，并且VdOAZ基因表達能夠響應多胺水平變化，暗示VdOAZ 蛋白具有OAZ 的功能。VdOAZ基因敲除導致大麗輪枝菌菌落生長速率降低，產孢量和微菌核形成減少，對寄主的致病力下降，在感病棉花莖中的生物量減少，表明VdOAZ基因與大麗輪枝菌的孢子產生、微菌核形成和致病力相關；VdOAZ基因負調控其他與孢子產生、微菌核形成和致病力相關基因（VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1） 的表達，推測VdOAZ基因通過與cAMP 信號途徑、MAPK 信息素調控途徑及轉錄因子調控途徑相互作用影響大麗輪枝菌孢子產生、微菌核形成和致病過程。