田振華， 李 幸， 王 浩

(1.陜西科技大學 輕工科學與工程學院 輕化工程國家級實驗教學示范中心， 陜西 西安 710021; 2.中國皮革和制鞋研究院， 福建 晉江 362201)

0 引言

制革是指將生皮鞣制成革的過程.在制革過程中會對牛皮進行浸灰、浸酸等鞣前處理，去除毛和非膠原成分并適度松散膠原纖維，以便于促進鞣劑、加脂劑等化料的均勻滲透.通常，膠原在強酸(硫酸等)、強堿(石灰、氫氧化鈉等)長時間作用時，膠原分子內(nèi)的氫鍵會發(fā)生斷裂、肽鍵可能會被水解，從而導致膠原二級結(jié)構(gòu)(三股螺旋結(jié)構(gòu))的崩塌.

對于強酸、強堿對膠原二級結(jié)構(gòu)的影響，已有研究表明浸灰過程所使用的強堿對裸皮中膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)沒有太大影響[1]；對于浸酸過程，Chen等[2]在不浸酸鉻鞣劑C-2000的應(yīng)用研究中提到在牛皮的浸酸過程中，皮膠原和許多酸溶性、鹽溶性蛋白質(zhì)會有所損失，但未進一步研究膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)的變化.因此，探究浸酸過程對膠原的結(jié)構(gòu)與物化性質(zhì)方面的影響具有重要的意義.

更為重要的是，制革原材料——生皮的主要成分膠原也是一種非常熱門的天然高分子材料，因具有良好的生物相容性、低抗原性、可生物降解性，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、化妝品、生物材料、功能食品等領(lǐng)域[3].目前，針對牛皮膠原的提取主要采用的原材料有鮮皮與灰堿皮[1,4].其中，鮮牛皮需經(jīng)刮毛、去肉、脫毛、脫脂、脫色等預(yù)處理去除非膠原成分，操作工序復雜、提取時間較長；灰堿皮提取膠原需要先進行脫灰脫鈣處理，對鈣殘留量要求較高，且灰堿皮本身無法長期儲存[5]；而對于浸酸皮，只需中和、水洗后便可用于膠原的提取，前處理工藝簡單、需時較短且浸酸皮便于保存.相比之下，從浸酸牛皮中提取膠原是一種相對便捷的方案.有專家針對酸腫皮即浸酸牛皮遇水充水膨脹、膠原纖維水解的裸皮進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原分子的成纖維能力明顯下降且所得纖維數(shù)量少、不成熟，所以酸腫皮作為鮮皮的替代物用于提取膠原可行性有限[6].

綜上，本文擬采用浸酸牛皮作為原材料提取膠原，并與鮮牛皮膠原進行對比，探究浸酸過程對膠原二級結(jié)構(gòu)的影響，并評估浸酸牛皮是否可作為原材料用于膠原提取的可行性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

(1)主要試劑：冰乙酸、氯化鈉、碳酸鈉等，分析純，廣東光華科技有限公司；胃蛋白酶，生化級，如香生物科技有限公司.

(2)主要儀器：傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker，Vector-22；微量差示掃描量熱儀，英國馬爾文，MicroCal VP-Capillary；旋轉(zhuǎn)粘度計，美國Brookfield，DV-II；電泳儀，美國Bio-rad，Protean Tetra；原子力顯微鏡，美國Agilent，AFM 5100.

1.2 鮮牛皮膠原和浸酸牛皮膠原的提取

1.2.1 牛皮的預(yù)處理

新鮮牛皮經(jīng)刮毛去肉、水洗后，采用灰堿處理24 h脫毛并去除部分非膠原成分，進一步去肉后將皮塊剪碎，水洗脫灰直至pH約為5 ～ 6.隨后采用脫脂劑進行脫脂24 h.隨后，采用7.5% NaCl溶液浸泡以除去鹽溶性非膠原成分，水洗除鹽后備用.

對于浸酸牛皮，只需采用Na2CO3中和，調(diào)節(jié)pH約為5 ～ 6，剪碎皮塊并水洗除鹽后備用.

1.2.2 膠原的提取與純化

將預(yù)處理好的兩種碎皮分別置于含有3%胃蛋白酶(EC 1∶3000)的0.5 mol/L醋酸溶液中，攪拌48 h后低溫高速離心10 min，取上清液.經(jīng)多次鹽析、離心、溶解、透析后得到兩種純化膠原溶液，最后將膠原溶液冷凍干燥，凍干膠原海綿于干燥器中保存?zhèn)溆?鮮皮膠原和浸酸皮膠原分別命名為FS和PS.

1.3 膠原的理化性質(zhì)檢測

1.3.1 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳

按照Laemmli[7]的SDS-PAGE方法分析膠原的分子量分布情況.將一定量的膠原與樣品處理液(Tris-HCl緩沖液、甘油、SDS等)混合均勻，煮沸5 min后冷卻備用.選用7.5%的分離膠和4%的積層膠進行電泳，分離結(jié)束后染色、脫色直到蛋白質(zhì)條帶清晰為止.

1.3.2 紫外分光光譜分析

將FS和PS分別溶于0.1 mol/L醋酸溶液中，制備濃度為1 mg/mL的膠原溶液.以0.1 mol/L醋酸溶液作空白，在190～600 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描.

1.3.3 傅里葉紅外分析

將FS和PS溶液分別于室溫下倒入聚四氟乙烯盤、自然干燥成膜.為避免膠原膜中醋酸的影響，使用超純水對膠原膜進行浸泡，清洗除去醋酸，自然干燥后置于干燥器中平衡水分.采用傅里葉紅外光譜儀獲取紅外譜圖.測定范圍為400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描信號累計64次.

1.3.4 表觀粘度

將膠原海綿溶解于0.1 mol/L醋酸溶液中，制備濃度為2 mg/mL的膠原溶液.在室溫下，采用旋轉(zhuǎn)粘度計監(jiān)測膠原溶液的表觀粘度與剪切速率的關(guān)系曲線.測試溫度為25±0.1 ℃，剪切速率的范圍為0.01～1 s-1.采用以下三種模型對所得到的表觀粘度數(shù)據(jù)進行擬合.

(1)Ostwald-de Waele模型：

(1)

(2)Carreau模型[8]：

(2)

式(2)中：η0和η∞分別指零剪切粘度和無窮剪切粘度(Pa·s)；λ是特征時間；m是材料常數(shù)，相當Ostwald-de Waele模型中的參數(shù)n，無量綱.

(3)Cross模型[9]：

(3)

式(3)中：k和a是材料常數(shù).其中，a相當Ostwald-de Waele模型中的參數(shù)n，無量綱.

1.3.5 微量差示掃描量熱分析(US-DSC)

將FS和PS分別溶于0.1 mol/L醋酸溶液中，制備濃度為0.5 mg/mL的膠原溶液.以0.1 mol/L醋酸溶液作空白；升溫速率為1 ℃/min，溫度范圍為25 ℃～60 ℃,繪制吸熱曲線并對吸熱峰進行積分計算得到樣品的焓變值(ΔH).

1.3.6 成纖維動力學測試

將凍干膠原海綿剪碎后溶于磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4+100 mmol/L NaCl，pH7.4)制備1 mg/mL的膠原溶液.將膠原溶液置于37 ℃恒溫水浴中，記錄60 min內(nèi)其在313 nm處的吸光度數(shù)值.

1.3.7 原子力顯微鏡(AFM)觀察

將15μL 1.3.6中所得到的膠原纖維滴加在新剝離的云母片上，使其自然鋪展，自然干燥24 h.使用AFM觀察樣品的表面形貌.采用軟件ImageJ 1.44測量膠原纖維的直徑并繪制直徑分布圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原的分子量分布分析

圖1為PS與FS的外觀圖及電泳圖.由圖1(a)可知，兩種膠原溶液均呈現(xiàn)澄清透明.由SDS-PAGE譜圖1(b)可知，兩種膠原的電泳條帶類似，均有三條不同的條帶.對照蛋白質(zhì)標準樣可知，分子量約在100 kDa附近的兩條電泳條帶分別對應(yīng)膠原的α1鏈和α2鏈，在200 kDa附近的條帶為膠原的β鏈.由條帶的深淺程度可推測α1鏈濃度高于α2，并且PS與FS電泳譜圖類似，保留了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu).此外，電泳圖中除兩條α帶和一條β帶外無其余小分子條帶，說明所提取的膠原中無小分子水解膠原或雜蛋白[10].綜上可知，所提取的膠原主要為I型膠原且純度較高.

(a)外觀圖 (b)電泳圖 圖1 FS和PS的外觀圖與SDS-PAGE 電泳譜圖

2.2 紫外圖譜分析

圖2是FS和PS的紫外吸收光譜圖.蛋白質(zhì)的紫外光譜圖實際上是蛋白質(zhì)分子的各種紫外生色基團加和的結(jié)果，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm處有最大紫外吸收，然而膠原不含有色氨酸，故在280 nm處無明顯紫外吸收峰[11].FS和PS的紫外吸收峰分別在223 nm和218 nm處，均在膠原的特征紫外吸收峰215～230 nm范圍內(nèi)，表明從浸酸牛皮、鮮牛皮中提取的產(chǎn)物是膠原，該吸收峰的出現(xiàn)主要是由于肽鏈中C=O鍵的n→π*躍遷產(chǎn)生的.

2.3 紅外圖譜分析

圖3是FS和PS的紅外(FTIR)圖譜.膠原的FTIR圖譜主要來自于酰胺基團的貢獻.根據(jù)標準手冊與相關(guān)文獻[12]，對PS和FS的特征吸收峰進行指認.其特征吸收峰主要包括在3 320 cm-1附近歸屬于N-H伸縮振動和氫鍵耦合的酰胺A帶、來源于C-H伸縮振動在3 080 cm-1處附近出現(xiàn)的酰胺B帶、1 658 cm-1和1 653 cm-1處的酰胺Ⅰ帶(C=O伸縮振動和C-N伸縮振動)、在1 552 cm-1和1 554 cm-1處歸屬于N-H伸縮振動和C-N伸縮振動的酰胺Ⅱ帶、分別在1 238 cm-1、1 232 cm-1處酰胺Ⅲ帶(N-H彎曲振動)和1 450 cm-1附近的CH3反對稱彎曲振動[12].

圖2 FS和PS的紫外光譜圖

圖3 PS和FS的紅外吸收光譜圖

其中酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶與膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，Albu等[13]提出了兩種檢測膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性的方法.第一種方法是計算酰胺Ⅲ帶和1 450 cm-1處的吸光度的比值即AⅢ/A1450，當比值約為1.00時表明結(jié)構(gòu)保留，反之，比值遠小于1.00時則說明膠原已變性，如明膠的比值為0.59[14]；第二種方法是計算酰胺Ⅰ和Ⅱ帶所在波數(shù)的差值即Δv=vⅠ-vⅡ，當差值遠大于100 cm-1時表示膠原已變性.根據(jù)上述方法對PS的三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性進行評估.PS的Δv值和AⅢ/A1450值分別為106 cm-1和1.008 6，類似于FS(99 cm-1、1.008 8)，說明浸酸皮膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整，與鮮牛皮膠原具有相同的化學結(jié)構(gòu).

2.4 表觀粘度分析

圖4為FS和PS溶液的表觀粘度與剪切速率的關(guān)系曲線.當剪切速率在0～0.2 s-1的范圍內(nèi)粘度急速下降，0.2～1.0 s-1的范圍內(nèi)粘度逐漸趨于平緩，所提取膠原溶液整體均呈現(xiàn)出剪切變稀行為.由于膠原分子在溶液中主要以穩(wěn)定的聚集形式存在，當受到剪切作用時，首先膠原聚集體間的纏結(jié)逐漸被破環(huán)，膠原聚集體解體；隨后膠原分子間物理纏結(jié)被破壞，使得膠原易于滑動，導致剪切粘度明顯降低，最終膠原聚集體完全解離為膠原分子且膠原分子沿剪切力方向發(fā)生取向性，因此在高剪切速率范圍內(nèi)剪切粘度趨于常數(shù)[15].此外，在0.1 s-1剪切速率時，F(xiàn)S溶液的表觀粘度(0.114 Pa·s)略大于PS溶液的表觀粘度(0.109 Pa·s).因此，F(xiàn)S聚集體纏結(jié)較多，結(jié)構(gòu)較為緊密.

圖4 PS和FS溶液的表觀粘度曲線

2.5 粘度測試數(shù)學模型擬合分析

圖5為Ostwald-de Waele、Carreau和Cross模型對FS和PS溶液的表觀粘度數(shù)據(jù)的擬合曲線.由圖5可知，三種模型的擬合曲線和實驗曲線均具有良好的疊加，說明了三種模型都能較好地描述PS和FS溶液的表觀粘度曲線.表1是三種模型擬合所得到的參數(shù).比較三種模型的重合性和回歸系數(shù)R2，較好的重合性、較高的R2值和較低的標準差SD值說明Cross模型可以更為準確地描述膠原溶液的穩(wěn)態(tài)剪切流動.

從表1可知，非牛頓指數(shù)n、m和a均小于1，表明兩種膠原溶液為典型的假塑性流體，均具有剪切變稀的特點.Ostwald-de Waele模型擬合所得粘度相關(guān)系數(shù)K值以及Carreau和Cross模型擬合所得零剪切粘度η0和η0′，表明PS溶液的粘度大于FS溶液的粘度，與實驗結(jié)果一致，證實了浸酸皮膠原聚集體纏結(jié)較多，結(jié)構(gòu)較為緊密.此外，由Carreau和Cross模型擬合所得無窮剪切粘度η∞和η∞′接近于0可知當剪切速率無窮大時，膠原分子沿剪切力方向發(fā)生取向性，分子間摩擦力非常小，因此粘度趨于0.

(a)PS溶液的表觀粘度數(shù)據(jù)擬合曲線

(b)FS溶液的表觀粘度數(shù)據(jù)擬合曲線圖5 Ostwald-de Waele、Carreau和Cross模 型對PS和FS溶液的表觀粘度數(shù)據(jù)擬合曲線表1 Ostwald-de Waele、Carreau和Cross模型擬合所得到的參數(shù)

ModelParameterSamplePSFSOstwald-de WaelemodelKnR2SD0.205±0.0070.712±0.0190.9450.1800.194±0.0080.708±0.0250.9130.181Carreau modelη0η∞λmR2SD0.335±0.0044.807E-282.208±0.1250.609±0.0060.9990.0920.301±0.0071E-321.581±0.1800.563±0.0160.9940.092Cross modelη0′η∞′kaR2SD0.377±0.0040.026±0.0070.666±0.0550.742±0.0530.9980.0920.330±0.0080.010±0.0050.465±0.0310.777±0.0410.9990.081

2.6 膠原熱動態(tài)分析

圖6是PS和FS溶液的熱容與溫度的關(guān)系曲線.典型的膠原溶液的US-DSC曲線有兩個吸熱峰，分別代表膠原溶液的預(yù)轉(zhuǎn)變和變性轉(zhuǎn)變過程[16]，相應(yīng)的溫度由Tm1和Tm2表示.結(jié)合圖6和表2可知，PS的Tm1和Tm2均低于FS，而焓變(ΔH)表示破壞維持膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵所需要的能量，兩個現(xiàn)象均表明浸酸皮膠原溶液的熱動態(tài)穩(wěn)定性略低于鮮牛皮膠原.

圖6 PS和FS溶液的熱容與溫度的關(guān)系曲線表2 PS和FS溶液的熱轉(zhuǎn)變溫度和焓變

SampleTm1/℃Tm2/℃ΔH/(kJ/mol)PS35.541.71.52×104 FS36.042.61.99×104

膠原的熱變性過程主要是指膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的崩塌、肽鏈解螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的過程，而其中氫鍵作用對其熱穩(wěn)定性起著關(guān)鍵性的作用.據(jù)報道，膠原分子X位上的酰胺基與甘氨酸上的羰基之間所形成的氫鍵需要水分子作為架橋，而這些通過水分子作為架橋形成的氫鍵對膠原的穩(wěn)定性起到重要的作用且有助于穩(wěn)定膠原分子中缺乏脯氨酸的三股螺旋區(qū)域.膠原分子間纏結(jié)較多會導致膠原形成較大的聚集體，膠原分子間疏水作用增強，因此膠原分子內(nèi)以水分子為架橋形成的氫鍵減少，從而膠原分子的穩(wěn)定性下降，即膠原溶液中分子纏結(jié)較多，熱穩(wěn)定性較低.此外，膠原分子的熱變性過程是一個吸熱過程，受到熱量傳遞速率的影響.膠原分子間纏結(jié)增多意味著膠原分子間間距較小，熱傳遞速率較快會加速膠原的變性[17].通過上述分析可知，由于PS溶液中膠原聚集體纏結(jié)較多，結(jié)構(gòu)較為緊密，因此以水分子為架橋形成的氫鍵減少且分子間熱傳遞速率較快導致膠原溶液的熱穩(wěn)定性較低，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)變溫度和焓變較小.

2.7 成纖維性能

圖7是PS和FS的濁度曲線.在37 ℃下，膠原溶液的吸光度在15 min內(nèi)快速增大，之后即可達到平穩(wěn)的平臺，說明兩種膠原均具有良好的成纖維性能且成纖維速率較快.比較PS和FS的吸光度增加值可知，PS的成纖維能力較弱[18].

圖7 PS和FS溶液的濁度曲線

為了更加直觀地考察膠原纖維的結(jié)構(gòu)，采用原子力顯微鏡觀測膠原纖維形貌并分析膠原纖維的平均直徑和直徑分布,如圖8所示.

(a)FS纖維的AFM圖 (b)PS纖維的AFM圖

(c)FS纖維的直徑分布圖 (d)PS纖維的直徑分布圖圖8 PS和FS纖維的AFM圖 和纖維直徑分布圖

由圖8(a)、(b)可看出，F(xiàn)S和PS膠原纖維均呈現(xiàn)出成熟的纖維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原纖維互相緊密纏繞在一起且排列隨機雜亂，無方向性.對比FS和PS膠原纖維的直徑，可知PS膠原纖維平均直徑為44.56±8.55 nm，略細于FS膠原纖維(51.25±6.47 nm)，因此表現(xiàn)為吸光度較低.其中，PS膠原纖維主要集中分布在30～60 nm，而FS膠原纖維主要集中分布于40～60 nm.

3 結(jié)論

以制革過程中間物——浸酸牛皮為原料提取膠原，并與鮮牛皮所提取的膠原進行對比.通過電泳、紅外、紫外結(jié)果可知兩種膠原結(jié)構(gòu)基本一致，具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)且純度較高.旋轉(zhuǎn)粘度計測定結(jié)果表明，浸酸皮膠原溶液中聚集體纏結(jié)較多因此熱穩(wěn)定性較鮮牛皮膠原溶液偏低、粘度比鮮牛皮膠原溶液稍高；此外二者體系均屬于假塑性流體、呈現(xiàn)剪切變稀行為且成纖維能力相近，說明浸酸過程對膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)無明顯影響；浸酸牛皮作為提取膠原的原材料是可行的且操作簡單、周期較短.