陳旭濤 萬(wàn)卓 韋夢(mèng)影 楊國(guó)棟 宋應(yīng)亮

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在間充質(zhì)干細(xì)胞中最早被發(fā)現(xiàn)，并長(zhǎng)期應(yīng)用于組織工程和干細(xì)胞研究領(lǐng)域中[1-2]。2001 年Zuk等[3]在脂肪組織中分離提取出了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)，隨后大量研究證實(shí)了其與BMSCs有著相似的多向分化潛能[4-5]。而ADSCs相對(duì)BMSCs取材容易、創(chuàng)傷小、易擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)也引起了各方廣泛關(guān)注，逐漸成為時(shí)下研究熱點(diǎn)。BMSCs與ADSCs是眾多間充質(zhì)干細(xì)胞中來(lái)源最豐富的，且被廣泛應(yīng)用于目前相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究與臨床運(yùn)用中。但隨著對(duì)這2 種不同組織起源的間充質(zhì)干細(xì)胞的深入研究，大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有更高的成骨和成軟骨傾向[6-7]，而ADSCs則具有更高的成脂、成血管傾向[8-9]。后期Dmitrieva等[10]還發(fā)現(xiàn)，相較于BMSCs，ADSCs有著更強(qiáng)的增殖潛能。此外，ADSCs與BMSCs不僅在分化表型以及增殖能力上存在差異，二者之間在免疫表型上也存在著相似但不同的地方[11]。BMSCs與ADSCs均屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，在組織工程，再生與修復(fù)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域起到重要作用，但其功能及表型差異機(jī)制尚未闡明。

近年來(lái)，隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)的研究日益深入，研究者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾不僅參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖等重要細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，而且在生物的適應(yīng)性和變異性中也起著重要的調(diào)控作用[12]。常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾有DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾等，其中DNA 甲基化是目前研究最廣泛最透徹的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，其通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶將來(lái)源自S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，隨后通過(guò)DNA的復(fù)制向下遺傳[13]。DNA甲基化能引起DNA與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，影響其與蛋白質(zhì)相互作用方式，進(jìn)而導(dǎo)致基因的表達(dá)改變[12]。本研究利用 DNA 甲基化測(cè)序技術(shù)分析BMSCs與ADSCs 基因組甲基化分布差異情況，為進(jìn)一步分析BMSCs與ADSCs分化和免疫表型差異提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM(Gibco，美國(guó))；胎牛血清，青鏈霉素雙抗(HyClone，美國(guó))；成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(蘇州賽業(yè))；膠原酶I、油紅O、茜素紅S染色液(Sigma，美國(guó))；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29、CD90、CD34、CD45(BD Pharmingen，美國(guó))；基因組DNA提取試劑盒(北京天根)；CO2培養(yǎng)箱(Shellab，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；SD大鼠(8 周，SPF級(jí))，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 ADSCs與BMSCs的原代培養(yǎng)

ADSCs提取方法：SD大鼠脫頸處死后在超凈臺(tái)中取皮下脂肪于培養(yǎng)皿中，將脂肪組織剪碎至糜狀后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等體積0.1%膠原酶Ⅰ，將離心管置于37 ℃搖床(200 r/min)中消化50 min。取等體積α-MEM終止消化后，用200目鋼篩過(guò)濾，收集過(guò)濾后的液體于離心管中離心5 min(1 000 r/min)。培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并均勻鋪于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃， 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

BMSCs提取方法： SD大鼠脫頸處死后于超凈臺(tái)中取大鼠股骨、脛骨于培養(yǎng)皿中，用注射器將骨髓沖出至骨膜發(fā)白，收集骨髓于無(wú)菌離心管中。加入2～3 ml紅細(xì)胞裂解液裂解5 min。收集裂解產(chǎn)物于離心管中離心5 min(1 000 r/min)。培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并均勻鋪于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃， 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 ADSCs與BMSCs的表面抗原檢測(cè)

利用胰酶將ADSCs與BMSCs兩組細(xì)胞分別消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。PBS離心洗滌1 次后棄上清，100 μl PBS重懸，分別加入FITC標(biāo)記的IgG、CD29、CD90、CD34、CD45抗體冰上避光孵育15 min后， PBS洗滌3 次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 ADSCs與BMSCs的成脂、成骨誘導(dǎo)

將第2 代ADSCs與BMSCs消化后分別制成細(xì)胞懸液，并以2×105/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞擴(kuò)增至80%左右時(shí)，分別加入成脂、成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。成脂誘導(dǎo)14 d， 換液1 次/3 d，誘導(dǎo)結(jié)束后，4%多聚甲醛固定20 min，油紅O染色并拍照。成骨誘導(dǎo)21 d， 換液1 次/3 d，誘導(dǎo)結(jié)束后， 4%多聚甲醛固定20 min，行茜素紅染色并拍照。

1.5 DNA提取與樣品檢驗(yàn)

胰酶消化ADSCs和BMSCs，PBS吹打洗滌2 次，10 000 r/min離心后，棄上清，加入200 μl緩沖液GA， 4 μl RnaseA震蕩混勻靜置5 min，隨后加入 20 μl Proteinase K溶液，混勻。余下具體步驟參照TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書(shū)。取50 ng DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，如電泳結(jié)果為規(guī)則單一條帶則為合格樣品。準(zhǔn)備DNA樣品：總量≥3 μg，濃度≥50 ng/ul；A260/280在1.8～2.0之間、A260/230>1.4、無(wú)降解，無(wú)蛋白及RNA污染，送公司分析(成都生命基線科技有限公司)。

1.6 文庫(kù)構(gòu)建及分析

①利用超聲將基因組DNA打斷為300 bp的小片段; ②用修復(fù)緩沖液進(jìn)行DNA末端片段修復(fù)、A尾緩沖液進(jìn)行3' 端加A堿基，連接測(cè)序接頭; ③采用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold kit對(duì)DNA樣本進(jìn)行Bisulfite處理; ④脫鹽處理后切膠回收，并選擇合適大小的文庫(kù)片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理后再次進(jìn)行文庫(kù)片段大小選擇; ⑤選擇合格的文庫(kù)用于上機(jī)測(cè)序(華大基因科技有限公司); ⑥將測(cè)序結(jié)果與參考基因組后進(jìn)行信息分析及個(gè)性化分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)卡方檢驗(yàn)確定樣品間是否存在差異來(lái)進(jìn)行DMR篩選，進(jìn)一步采用GoMiner 數(shù)據(jù)庫(kù)行基因本體(gene ontology，GO)分析和Pathway分析。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs與BMSCs的細(xì)胞鑒定

將正常大鼠骨髓與脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs與BMSCs的純度(圖1)，細(xì)胞中CD29、CD90表達(dá)為陽(yáng)性，CD34、CD45為陰性。然后通過(guò)成脂和成骨誘導(dǎo)方法來(lái)評(píng)價(jià)ADSCs與BMSCs的分化潛能(圖2)，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后以及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，對(duì)2 組不同來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行油紅O以及茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)， 2 組細(xì)胞均具有多向分化潛能。

2.2 ADSCs與BMSCs全基因組甲基化數(shù)量及水平分析

ADSCs全基因組水平中CG，CHG以及CHH甲基化位點(diǎn)的數(shù)量均多于BMSCs(表1)；從不同區(qū)域以及功能元件C甲基化水平比較而言，ADSCs與BMSCs基因組在啟動(dòng)子區(qū)均呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，但ADSCs基因組在啟動(dòng)子區(qū)以及5'UTR端CG甲基化水平高于BMSCs(圖3， 表2)。

圖1 ADSCs與BMSCs的干細(xì)胞標(biāo)志物流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(%)

圖2 ADMSCs和BMSCs成脂成骨分化 (×100)

Fig 2 Adipogenic differentiation and osteogenic differentiation of ADSCs and BMSCs (×100)

2.3 差異性甲基化區(qū)域(DMR)分析

差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions，DMR)指在不同樣本中基因組表現(xiàn)出不同的甲基化狀態(tài)的DNA片段。其中，CG甲基化水平不同的DMR分析結(jié)果如表3所示，BMSCs與ADSCs基因組間在常染色體與性染色體基因組上存在大量DMR。

表1 ADSCs與BMSCs不同分布類型甲基化C的數(shù)量及比例

Tab 1 The number and proportion of different distribution types of methylation C of ADSCs and BMSCs

mCGmCHGmCHHADSCsmC number31826778253825774791proportion (%)96.8690.7732.358BMSCsmC number27628406180490520786proportion (%)97.5250.6371.838

2.4 DMR關(guān)聯(lián)基因分析

對(duì)所有染色體上DMR相關(guān)基因進(jìn)行GO(gene ontology)和Pathway分析，共富集到4 603 條GO條目，其中610 條GO條目具有顯著差異(P<0.05)(圖4)。通過(guò)Pathway分析可以得到322 條通路，其中有98條通路顯著富集(P<0.05)(圖5， 表4)。其中，癌癥相關(guān)通路，MAPK信號(hào)通路，Ras信號(hào)通路及相關(guān)基因等在BMSCs與ADSCs基因組中甲基化水平差異顯著。

圖3 ADSCs與BMSCs全基因組不同功能元件區(qū)域的甲基化平均水平分布

Fig 3 The distribution of methylation level in different functional elements in ADSCs and BMSCs genome

3 討 論

DNA甲基化可以發(fā)生在啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)座子、沉默子等不同基因區(qū)域和功能元件上。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠BMSCs與ADSCs的全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)BMSCs與ADSCs在全基因組甲基化上存在差異且這種差異分布于各條染色體中，同時(shí)ADSCs全基因組甲基化位點(diǎn)數(shù)量顯著高于BMSCs。進(jìn)一步對(duì)CG甲基化水平不同的DMR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BMSCs與ADSCs基因組間在常染色體與性染色體基因組上存在大量CG甲基化水平不同的DMR，而這些DMR可能是導(dǎo)致BMSCs和ADSCs功能與表型差異的重要因素之一。有趣的是，本研究觀察到在2 種細(xì)胞中基因啟動(dòng)子區(qū)雖均呈低甲基化狀態(tài)，但ADSCs啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高于甲基化，這可能是探究BMSCs與ADSCs功能差異的重要靶點(diǎn)之一。本研究一共檢測(cè)到10 萬(wàn)多個(gè)甲基化差異位點(diǎn)，其中通過(guò)GO分析和Pathway分析，富集到4 000多個(gè)GO條目和300 多個(gè)通路，這些通路和基因?qū)Ρ狙芯緽MSCs與ADSCs的差異具有重要的指導(dǎo)意義。

表2 ADSCs與BMSCs不同基因區(qū)域和功能元件上各類型C的甲基化水平

表觀遺傳學(xué)在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等重要生命過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。盡管MSCs在同種異體應(yīng)用(或使用HLA匹配的供體細(xì)胞)中具有很好臨床前景，但是在一些治療中仍然需要自體移植方法，例如長(zhǎng)期植入MSCs衍生的工程化組織，這使得無(wú)法獲得足夠數(shù)量的所需細(xì)胞類型成為MSCs治療的重大挑戰(zhàn)。下一步通過(guò)功能及表觀編輯，闡明決定功能差異的關(guān)鍵甲基化基因，可以在此基礎(chǔ)上通過(guò)改變這些差異基因的甲基化狀態(tài)來(lái)改造這2 種細(xì)胞，使其更易向我們需要的方向分化發(fā)展，這對(duì)組織工程及再生醫(yī)學(xué)有著非常重要的意義。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，表觀遺傳標(biāo)記之間存在著相互作用，如DNA甲基化和組蛋白乙?；g協(xié)同參與了基因轉(zhuǎn)錄和異?；虺聊倪^(guò)程[14-18]。一些研究表明，在基因沉默過(guò)程中，DNA甲基化的水平和模式指導(dǎo)組蛋白修飾，但另一些研究則認(rèn)為，DNA甲基化的狀況受到組蛋白修飾狀態(tài)的影響。到目前為止，人們對(duì)基因激活的各種機(jī)制已經(jīng)有了較為深入的了解，但在研究基因沉默時(shí)，表觀遺傳標(biāo)記之間的相互作用機(jī)制以及級(jí)聯(lián)順序方面仍存在著許多的未知。即使還需要更多關(guān)于以上問(wèn)題的探索，但不同類型的表觀遺傳標(biāo)記之間的密切相關(guān)性是一定的，且常常以自我強(qiáng)化的方式在調(diào)節(jié)不同的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。因此，通過(guò)BMSCs和ADSCs全基因組DNA甲基化的差異分析，提示我們BMSCs和ADSCs在其它表觀遺傳標(biāo)記上可能同樣存在差異，并與DNA甲基化協(xié)同發(fā)揮作用影響B(tài)MSCs和ADSCs在分化和免疫表型上的差異。

表3 ADSCs與BMSCs基因組DMR數(shù)目及長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

圖4 ADSCs與BMSCs的DMR GO分析結(jié)果 圖5 ADSCs與BMSCs的DMR相關(guān)基因的Pathway功能顯著性富集分析(前20)

Fig 4 The results of DMR GO analysis of ADSCs and BMSCs Fig 5 The functional enrichment analysis of the pathway of DMR-related genes of ADSCs and BMSCs (top 20)

表4 DMR相關(guān)Pathway中的差異基因數(shù)目(前10)

Tab 4 The number of differential genes in DMR-related pathways(top10)

本研究中發(fā)現(xiàn)的基因甲基化位點(diǎn)、甲基化水平與相應(yīng)基因的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。深入探討它們之間的關(guān)系，及其與細(xì)胞功能表型差異的關(guān)系有望為表觀編輯ADSCs和BMSCs，增強(qiáng)其定向分化的潛能提供新的思路。