劉露 張青 翟啟明 劉安琪 劉文佳 金鈁

目前對(duì)脊髓損傷(SCI，spinal cord injury)尚無有效的治療方法，細(xì)胞移植如胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等為其帶來曙光[1]。由于存在移植物來源限制、 免疫排斥反應(yīng)等問題，限制了前者的臨床應(yīng)用；而間充質(zhì)干細(xì)胞在此方面有明顯優(yōu)勢(shì)，成為新的研究熱點(diǎn)。脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(SHEDs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)易于收集利用，越來越多關(guān)于其應(yīng)用于脊髓損傷治療的研究[2-3],然而尚沒有研究比較二者的療效。

對(duì)于嚴(yán)重的脊髓全橫斷損傷，研究中常用的修復(fù)方法是干細(xì)胞復(fù)合外源性支架材料移植[4]，但支架材料的安全性及轉(zhuǎn)歸有待驗(yàn)證。近年來一種基于細(xì)胞膜片工程的細(xì)胞聚合體技術(shù)作為組織工程的新秀引起大家的注意[5]。細(xì)胞聚合體含大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)內(nèi)源性支架，更有利于細(xì)胞存活、增殖、分化，且制備簡捷， 已有部分關(guān)于細(xì)胞聚合體技術(shù)應(yīng)用于心肌梗死、腎損傷、角膜損傷及牙周損傷等的治療[6-7]，本實(shí)驗(yàn)擬探究間充質(zhì)干細(xì)胞聚合體對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷修復(fù)的有效性，并對(duì)UCMSCs和SHEDs 2 種聚合體體外性能，體內(nèi)療效進(jìn)行對(duì)比，選出更為優(yōu)勢(shì)的方法，為臨床脊髓損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、 DMEM培養(yǎng)基、 胎牛血清FBS、 膠原酶、 Hanks' 溶液(Gibco，美國)； 胰蛋白酶(Invitrogen, 美國)； 維生素C、 熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體 CD29、 CD90、 CD31(eBioscience,美國)； CD105、 CD34、 CD45(Biolegend， 美國)； CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)； PCR試劑盒、 BDNF、 NGF ELISA檢測(cè)試劑盒(Raybiotech, 美國)。

1.2 SHEDs，UCMSCs的分離，培養(yǎng)及鑒定

SHEDs：從臨床獲取患者脫落的乳牙，PBS反復(fù)沖洗，無菌條件下取出牙髓，機(jī)械剪切加酶消化法制備成細(xì)胞懸液，離心后用含10%FBS及雙抗的α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種于T25的塑料培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長至80%～85%后正常傳代[8]。

UCMSCs：從公司獲得新鮮的人臍帶，在Hanks'平衡鹽溶液中清除臍帶血管,將間充質(zhì)組織切成約0.5 cm3的小塊， 250 g離心5 min。除去上清，用無血清DMEM洗滌沉淀物，離心后吸除上清；分別在37 ℃先后用膠原酶和2.5%胰蛋白酶處理18 h， 30 min；然后加入FBS停止消化。將解離的間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分散在10% FBS-DMEM中，直接用于培養(yǎng)或儲(chǔ)存在液氮中以備后用。

鑒定：鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待傳至P4代時(shí)，選對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定。常規(guī)消化離心，PBS重懸，以200 μl分裝至1.5 ml EP管中，每管不少于1×106個(gè)細(xì)胞。除空白管外，每管分別加入2 μl熒光標(biāo)記的抗人單克隆抗體CD29-FITC，CD90-PE, CD105-PE，CD31-PE，CD34-PE，CD45-PE，室溫避光孵育30 min，PBS洗3 次， 800 r/min×5 min， 最終以300 μl PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：在96 孔板中加入100 μl(2 000 個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液，孵箱內(nèi)培養(yǎng)1～7 d后分別檢測(cè)。加CCK-8溶液后繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處吸光度。

1.4 細(xì)胞聚合體的制備

將P5代細(xì)胞按3×105/孔接種于12孔板中，待細(xì)胞長至85%～90%時(shí)棄去原有培養(yǎng)液，加入含VC(50 μg/ml)的α-MEM培養(yǎng)基, 每2 天換液1 次， 3 d后肉眼可見白色膜狀結(jié)構(gòu)，并隨時(shí)間繼續(xù)增厚。培養(yǎng)7 d后用鑷子輕輕撕下細(xì)胞聚合體[9]，部分用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，部分切片做HE染色。

1.5 相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)情況

1.5.1 RT-PCR SHEDs，UCMSCs培養(yǎng)至P5代,提取細(xì)胞總RNA，用PCR RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用 CFX96 Real Time System在實(shí)時(shí)定量 PCR儀中完成擴(kuò)增和檢測(cè)。

1.5.2 ELISA 收集培養(yǎng)細(xì)胞聚合體第3 天和第7 天時(shí)的細(xì)胞上清，分別用 BDNF、NGF的ELISA試劑盒(按說明書操作)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 SHEDs和UCMSCs聚合體治療大鼠脊髓全橫斷損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序符合第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物使用及管理委員會(huì)規(guī)定。

1.6.1 建模及實(shí)驗(yàn)分組 建立大鼠脊髓全橫斷模型：180～200 g SD雌性大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后手術(shù)：去除T8-9椎板，暴露脊髓，顯微剪均勻剪除T9處一段脊髓組織，形成2 mm間隙[10]。 ①SHAM組(僅去除T8-9椎板,n=8)；②SCI only組(形成2 mm間隙，不治療,n=8)；③實(shí)驗(yàn)組A：SHEDs組(在2 mm間隙內(nèi)植入SHEDs聚合體，n=12)；④實(shí)驗(yàn)組B： UCMSCs組(在2 mm間隙內(nèi)植入U(xiǎn)CMSCs聚合體，n=12)； 之后分層縫合。大鼠蘇醒后雙后肢癱瘓，拖行。術(shù)后1 周腹腔注射慶大霉素防感染(1 次/d)；按壓膀胱輔助排尿(2 次/d)直至自主排尿功能恢復(fù)。

1.6.2 觀察指標(biāo) ①行為學(xué)評(píng)分: 實(shí)驗(yàn)大鼠分別在術(shù)后1～8 周每周進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，采用BBB評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠脊髓神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。將大鼠逐只放至開放場(chǎng)地中，每只5 min， 2 名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行盲評(píng)。 0-7: 關(guān)節(jié)是否動(dòng)(髖，膝，髁；幅度，頻率); 8-14：腳掌能否著地，著地后能否運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)否; 15-18：腳尖能否抓地，腳尖與前進(jìn)方向是否一致，前后肢運(yùn)動(dòng)是否協(xié)調(diào); 19-21：運(yùn)動(dòng)時(shí)軀干穩(wěn)定否，尾巴翹不翹。②組織切片觀察： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后第8 周麻醉，經(jīng)心臟灌注固定后取出損傷區(qū)脊髓組織(2 cm)，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色觀察脊髓損傷修復(fù)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

分離培養(yǎng)的SHEDs，UCMSCs細(xì)胞有良好的貼附塑料培養(yǎng)皿生長特性，在鏡下呈長梭形，放射狀或旋渦狀排布(圖1A)。生長曲線：前5 d SHEDs增殖活力明顯高于UCMSCs(P<0.05)， 6～7 d進(jìn)入平臺(tái)期(圖1B)。 通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定表型，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29, CD90, CD105為陽性表達(dá)，造血或內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31, CD34, CD45為陰性表達(dá)(圖1C)。

2.2 細(xì)胞聚合體特征

用含VC的培養(yǎng)基誘導(dǎo)一周后，SHEDs，UCMSCs形成完整的細(xì)胞聚合體，表現(xiàn)為膜樣形態(tài)，可在培養(yǎng)皿的邊緣分離，并能用鑷子機(jī)械撕除大體觀見圖2。HE染色顯示聚合體由多層細(xì)胞構(gòu)成，含大量細(xì)胞外基質(zhì);且SHEDs聚合體比UCMSCs聚合體厚見圖2。與CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果一致。

圖1 SHEDs和UCMSCs培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 RT-PCR BDNF, NGF, NTF3, GDNF等基因，在SHEDs細(xì)胞中表達(dá)明顯高于UCMSCs，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)； bFGF, CNTF在UCMSCs高表達(dá)(P<0.05)(圖3A)。

2.2.2 ELISA 第3 天和第7 天時(shí)BDNF和NGF的分泌SHEDs均高于UCMSCs，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尤其是第7 天時(shí)差異更明顯(P<0.01)。且隨時(shí)間延長，BDNF，NGF分泌量增多，第7 天SHEDs的NGF分泌量顯著高于第3 天(P<0.05)(圖3B)。

2.3 行為學(xué)評(píng)分

SCI組大鼠脊髓全橫斷損傷后，雙后肢完全癱瘓，BBB評(píng)分前2 周基本為0；隨時(shí)間延長，有一定程度恢復(fù)，但評(píng)分不超過3。SHAM組術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能輕度受損， 3 周后基本恢復(fù)正常。SHEDs組和UCMSCs組與SCI組相比，均有明顯恢復(fù)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001; 2 組均從第3 周開始出現(xiàn)明顯恢復(fù)，至第7 周進(jìn)入平臺(tái)期，最高評(píng)分分別達(dá)8 分、6 分； 且在第3、 4、 5、 7、 8 周時(shí)2 組BBB評(píng)分有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖4)。由此可見，SHEDs組比UCMSCs組療效好。

圖2 體外成聚合體誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后機(jī)械撕除大體觀及聚合體縱斷面 (HE, ×5)

Fig 2 Cell aggregates induced for 7 daysinvitroand mechanically teared into longitudinal sections of cell aggregates (HE, ×5)

圖3 SHEDs和UCMSCs神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)

2.4 HE結(jié)果

與SCI組比，SHEDs， UCMSCs聚合體移植后有效減小損傷區(qū)域面積；且脊髓損傷區(qū)兩斷端逆行性損傷病灶大?。篠HEDs組明顯小于UCMSCs組。高倍鏡下脊髓損傷后，在白質(zhì)中可見大量空洞形成且有許多細(xì)胞碎片，SCI組空洞多且面積大，組織雜亂，SHEDs，UCMSCs組空洞小而密集(圖5a1～a4); 灰質(zhì)中，神經(jīng)元胞體退化凋亡，尼氏體崩解，但SHEDs組比UCMSCs組胞體損傷少，存留藍(lán)染的尼氏體數(shù)目多(圖5b1～b4)；損傷中心，分散的群落狀的星形膠質(zhì)細(xì)胞(擁有巨大的細(xì)胞核及纖維狀細(xì)胞質(zhì)和細(xì)小突觸)及成纖維細(xì)胞形成大量瘢痕組織，UCMSCs組的瘢痕組織更為致密(圖5c2～c4); 損傷區(qū)域大量炎癥細(xì)胞浸潤，SHEDs組炎癥浸潤面積較UCMSCs組小(圖5d2～d4); SHEDs組損傷區(qū)靠近脊髓斷端處可見類似脊髓組織樣結(jié)構(gòu)生成，UCMSCs組可見成簇的細(xì)胞聚合體及周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤帶，未見明顯的再生脊髓樣組織(圖5e4)[11]。

圖4 大鼠運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分

3 討 論

脊髓損傷是一類高發(fā)病率， 高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。脊髓損傷后機(jī)體經(jīng)歷原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，造成不同程度的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的壞死、凋亡，脫髓鞘，以及微環(huán)境對(duì)再生修復(fù)的抑制，膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突再生的阻礙等，加上中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力極差[1]，所以對(duì)脊髓損傷的修復(fù)任重道遠(yuǎn)。目前臨床上對(duì)脊髓損傷常用的治療方法有：早期手術(shù)減壓，大劑量糖皮質(zhì)激素及神經(jīng)營養(yǎng)類藥物治療，理療等，但效果都不盡如人意，且不能實(shí)現(xiàn)真正的脊髓再生；而細(xì)胞移植有望實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生，是一種很有前景的治療方式[4]。

a： 白質(zhì)，神經(jīng)纖維； b： 灰質(zhì)，神經(jīng)元胞體聚集區(qū)，尼氏體； c： 瘢痕組織； d： 損傷區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤； e： 再生脊髓樣組織

圖5 脊髓損傷修復(fù)的組織學(xué)觀察 (HE， ×200)

a： White matter， nerve fibers; b： Bray matter， neuron cell bodies, Nissl; c： Scar Tissue; d： Inflammatory infiltration in injured areas; e： Regenerative spinal cord tissue

Fig 5 Histological observasion of spinal cord injury after treatment in the groups (HE， ×200)

UCMSCs和SHEDs因具有良好的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，且有來源優(yōu)勢(shì)，在脊髓損傷治療中有越來越多的應(yīng)用[3-4，12]，但對(duì)于兩者的療效比較及相關(guān)機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過比較二者體外生物學(xué)特征及體內(nèi)移植后的功能恢復(fù)情況，對(duì)此進(jìn)行初步探討。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：SHEDs比UCMSCs有更好的增殖能力，RT-PCR顯示：與軸突再生密切相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子基因BDNF，NGF，NTF3,GDNF等，在SHEDs細(xì)胞中明顯高表達(dá)；而另外一些基因：bFGF，CNTF在UCMSCs細(xì)胞高表達(dá)。蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果也相一致，SHEDs細(xì)胞分泌BDNF，NGF的能力明顯強(qiáng)于UCMSCs。

同時(shí)本研究創(chuàng)新性地利用細(xì)胞聚合體技術(shù)來修復(fù)脊髓損傷，減少了外源性支架的不利影響，便捷高效，體內(nèi)移植療效與之前研究相當(dāng)[3，12]，治療8 周后BBB評(píng)分高達(dá)8 分。HE結(jié)果也顯示損傷區(qū)域面積減小，瘢痕組織減少，并且SHEDs組出現(xiàn)疑似再生脊髓樣組織。細(xì)胞聚合體有干細(xì)胞龕的作用，細(xì)胞連接充分，大量細(xì)胞外基質(zhì)為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，更利于細(xì)胞的增殖和分化[7]。SHEDs組療效優(yōu)于UCMSCs組，可能因?yàn)镾HEDs是神經(jīng)嵴起源的細(xì)胞，已有大量研究表明其表達(dá)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，是治療神經(jīng)損傷及退行性疾病的理想資源[13]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)UCMSCs和SHEDs聚合體在增殖，神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)及體內(nèi)移植后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定和組織學(xué)觀察等方面的比較研究，發(fā)現(xiàn)二者以聚合體形式治療大鼠脊髓全橫斷損傷是可行的，并且很有效，SHEDs療效要優(yōu)于UCMSCs，為臨床治療提供新思路。二者可能是通過旁分泌功能發(fā)揮作用，不過具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。