陳麗娜，秦瑤，孫成丹，王晶，劉春明*

（1.長(zhǎng)春師范大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130032；2.北京知蜂堂健康科技股份有限公司，北京 102200）

玫瑰花含有豐富鞣質(zhì)、原花青素、黃酮、維生素C及人體所需的多種氨基酸和微量元素[1-4]，具有通經(jīng)活血、美容養(yǎng)顏等功效，被作為花茶和食材廣泛使用。隨著人們對(duì)食用玫瑰花需求的增加，栽培面積越來(lái)越大。玫瑰花栽培過(guò)程中常見(jiàn)銹病、黑莓病、白粉病等疾病以及玫瑰莖葉蜂、玫瑰中夜蛾、吹綿蚧及紅蜘蛛等害蟲[5-6]，因此需適當(dāng)噴灑農(nóng)藥已進(jìn)行預(yù)防和治療。但如果使用不合理，任意加大農(nóng)藥的噴施濃度或施藥后未按安全間隔期采收，都會(huì)造成農(nóng)藥殘留污染問(wèn)題[7-8]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要工具之一。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮短了分析時(shí)間，提高了工作效率[9]。QuEChERS方法是一種集提取與凈化為一體的樣品前處理方法，在農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)殘分析中具有很好的應(yīng)用前景[10]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)QuEChERS進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，研究了應(yīng)用UPLC-MS/MS分析玫瑰花中19種常用農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法。并應(yīng)用此方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了分析，獲得了較好的分析結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

玫瑰花樣品，購(gòu)買于長(zhǎng)春中東萬(wàn)家大藥房。UPLC所用的流動(dòng)相乙腈（色譜純，F(xiàn)isher，美國(guó)），甲酸、乙酸（色譜純, 阿拉?。籒-丙基乙二胺（PSA）、C18與石墨化碳粉末（GCB），均購(gòu)于Agela公司；氯化鈉（NaCl）、無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）、乙酸銨（NH4OAc）、乙酸鈉（NaAc）為分析純購(gòu)自北京化工廠，NaCl于120 ℃條件下在馬弗爐中加熱5 h，無(wú)水MgSO4在650 ℃條件下加熱4 h；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度＞95%，均購(gòu)自于Dr.EhrenstorferGmbH公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UPLC-MS/MS（ACQUITY UPLC, Xevo TQ-S,Waters公司），配有ESI離子源，三級(jí)四極桿質(zhì)量分析器；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）；離心機(jī)（3K30，Sigma公司）；渦旋混合器（QiLinBeier5，科學(xué)儀器廠）；氮?dú)獯蹈蓛x（YGC-24，鄭州寶晶公司），超純水制備儀（LabostarTMTWT UV7，SIEMENS公司）。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

利用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）分離；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01%甲酸水溶液，采用梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%～30% A；3.0～6.0 min，30%～50% A；6.0～6.5 min，50%～80% A；6.5～7.5 min，80%～95% A；7.5～9.0 min，95%～95% A；9.0～10.0 min，95%～10% A；10.0～12.0 min，10%～10%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5.0 μL。

UPLC系統(tǒng)配有三級(jí)四極桿質(zhì)譜，離子源為電噴霧電離離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行分析，質(zhì)譜操作參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓1.0 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量150 L/h，碰撞氣流量0.15 L/h。

1.4 樣品的前處理方法

稱取2 g玫瑰花樣品于50 mL的離心管中，并向其中加入10 mL的超純水及10 mL含有0.1%乙酸的乙腈，渦旋混勻1 min；稱取4 g無(wú)水MgSO4和1g NaCl，將其加入至離心管中，渦旋混勻1 min，在3500 r/min條件下離心5min。取2 mL的上層提取液加入至含有300 mg無(wú)水MgSO4、100 mgPSA及20 mgGCB混合物的10 mL離心管中，渦旋混勻1 min，在3500 r/min條件下離心5 min。取2 mL的提取液在30℃條件下氮吹至近干，用乙腈∶水（v/v，1∶9）溶液定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

首先以超純水作為水相，分別考察乙腈和甲醇作為有機(jī)相的分離效果。甲醇作為有機(jī)相時(shí)，化合物的峰形普遍較寬，且化合物的靈敏度相對(duì)乙腈低，因此選用乙腈作為有機(jī)相。但在乙腈-純水系統(tǒng)下，烯啶蟲胺與吡蚜酮的色譜峰形較寬且靈敏度較低，而向水中添加0.01%甲酸后色譜峰形得到改善。因此，最終的流動(dòng)相為乙腈-0.01%甲酸水溶液，同時(shí)對(duì)洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，色譜圖見(jiàn)圖1。

然后以乙腈∶水（v/v，1∶1）溶液稀釋農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直接注入質(zhì)譜中進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。在ESI+模式下，分別采用全掃描和子離子掃描方式優(yōu)化得到各個(gè)化合物的母離子、子離子、錐孔電壓以及碰撞能。其中，豐度比較高的子離子作為定量離子，豐度相對(duì)較弱的子離子作為定性離子。質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

圖1 19個(gè)化合物的總離子流圖

表1 19種農(nóng)藥的色譜及質(zhì)譜條件

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

常規(guī)的QuEChERS方法使用乙腈作為提取溶劑提取樣品中的多種農(nóng)藥殘留。由于PSA含有堿性基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致部分農(nóng)藥的回收率降低，因此本文考慮向乙腈中添加少量乙酸以提高回收率。

分別考察了乙腈、含有0.1%乙酸的乙腈、含有1%乙酸的乙腈3種提取溶劑的提取效率，見(jiàn)圖2。當(dāng)選用乙腈為提取溶劑時(shí)，烯啶蟲胺的回收率僅為6.5%，而1%乙酸乙腈為提取溶劑時(shí)，烯啶蟲胺和克百威的回收率同樣也不能滿足分析要求，二者回收率分別為36.3%和52.8%。含有0.1%乙酸的乙腈提取待測(cè)農(nóng)藥時(shí)，19種農(nóng)藥的回收率均在82.3%～101.6%，故選用含有0.1%乙酸的乙腈為提取溶劑。

2.2.2 混合鹽的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了3種混合鹽的凈化效果及對(duì)回收率的影響，分別為：（1）無(wú)水MgSO4+NaCl；（2）無(wú)水MgSO4+NH4OAc；（3）無(wú)水MgSO4+NaAc。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，當(dāng)使用第3組混合鹽時(shí)，丁硫克百威的回收率僅為54.3%；選用第1或第2組混合鹽時(shí)，農(nóng)藥的回收率均滿足分析要求且兩組之間的數(shù)值大小并無(wú)較大差別，但在實(shí)際操作中使用第1組混合鹽時(shí)，溶液的分層效果更佳，農(nóng)藥的回收率在89.8%～101.3%，因此選擇無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉為混合鹽。

2.2.3 凈化劑的優(yōu)化

根據(jù)基質(zhì)樣品中所含雜質(zhì)的特點(diǎn)對(duì)使用凈化劑的種類進(jìn)行優(yōu)化，考慮到玫瑰花樣品基質(zhì)的提取液比較干凈，因此減少了PSA的使用量。比較了每1 mL玫瑰花提取液添加不同質(zhì)量的PSA時(shí)化合物的回收率變化情況。當(dāng)添加50 mg的PSA時(shí)，各個(gè)化合物的回收率最高，因此每1 mL的玫瑰花提取液添加50 mg的PSA，見(jiàn)圖4。

由于不能準(zhǔn)確判斷玫瑰花中脂肪類物質(zhì)的含量，考察了玫瑰花提取液是否需要添加C18進(jìn)行凈化，見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)表明，添加C18凈化后各個(gè)化合物的回收率相對(duì)降低，吡蚜酮的回收率更低至11.2%，凈化液顏色并未出現(xiàn)明顯的變化，因此不添加C18。

圖2 不同提取溶劑的回收率（%，n=5）

圖3 不同混合鹽的回收率（%，n=5）

圖4 不同質(zhì)量的PSA的回收率（%，n=5）

圖5 不同凈化劑時(shí)農(nóng)藥的回收率（%, n=5）

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別用空白基質(zhì)提取液和乙腈∶水（v/v，1∶9）溶劑配制農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各化合物的峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列濃度繪制基質(zhì)校準(zhǔn)曲線及溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)（ME）數(shù)值用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。玫瑰花中只有吡蚜酮存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其他均為基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此通過(guò)基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正，增加定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 定量限與檢出限

用空白基質(zhì)提取溶液將農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，制備混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分峰面積（y）對(duì)濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，信噪比（S/N）大于10時(shí)，各化合物的定量離子對(duì)對(duì)應(yīng)的樣品濃度計(jì)算定量限（LOQ）；以信噪比（S/N）大于3時(shí)，各化合物的定量離子對(duì)對(duì)應(yīng)的樣品濃度計(jì)算檢出限（LOD）。線性方程、r2、LOQ、LOD見(jiàn)表3，多種農(nóng)藥在1～100 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LOD在0.023～0.26 μg/kg，LOQ在0.078～0.870μg/kg。

2.5 回收率與精密度

選取不含農(nóng)藥的玫瑰花樣品，利用1.4優(yōu)化后的方法處理，設(shè)定3個(gè)不同濃度的添加水平（1、5、10 μg/kg），進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表4。19種農(nóng)藥的回收率在77.8%～110.9%，RSDr為1.1%～14.7%，RSDR為2.5%～17.6%。

表3 19種農(nóng)藥的線性方程、R2、ME、LOD、LOQ

表4 19種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

在市場(chǎng)購(gòu)買3份玫瑰花樣品，進(jìn)行檢測(cè)。啶蟲脒在3份樣品中均有檢出，其中1份樣品的啶蟲脒含量為0.39 μg/kg，其余2份的含量低于定量限。除此之外，在另一份樣品中多菌靈和吡蟲啉也有檢出，含量分別為0.17 μg/kg和0.93 μg/kg，其他農(nóng)藥未有檢出。

3 小結(jié)

本研究建立了同時(shí)檢測(cè)玫瑰花中19種農(nóng)藥殘留的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。該方法采用0.1%乙酸乙腈提取待測(cè)農(nóng)藥，經(jīng)無(wú)水MgSO4和NaCl混合鹽分離后，以PSA和GCB對(duì)提取液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)對(duì)所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，包括基質(zhì)效應(yīng)、定量限、檢出限、回收率及精密度。結(jié)果表明，該方法的回收率在77.8%～110.9%，RSD≤17.6%，符合歐盟檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（回收率在70%～120%，RSD＜20%）。所建立的方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可對(duì)待測(cè)農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，節(jié)省分析時(shí)間，在花類中藥材的農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)中有極大的應(yīng)用發(fā)展空間。