李豪，鄒偉,2*，白光劍，徐靜

1(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000) 2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川理工學(xué)院)，四川 自貢，643000)

農(nóng)作物秸稈是目前自然界中最豐富的可再生資源，目前的利用方式主要包括還田、秸稈飼料、秸稈能源、秸稈工業(yè)原料和栽培食用菌[1]。農(nóng)作物秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素[2-3]，3種物質(zhì)相互結(jié)合形成木質(zhì)纖維素占秸稈干重的一半以上[4]。目前化學(xué)處理法如稀酸、濃酸處理等會(huì)帶來成本問題、環(huán)境污染而難以推廣，物理處理法多高耗能而不宜推廣[5-6]。使用微生物處理秸稈具有綠色環(huán)保、成本低的優(yōu)勢(shì)，近年來受到越來越多的關(guān)注。

目前主要運(yùn)用高產(chǎn)纖維素酶的菌株來處理農(nóng)作物秸稈。纖維素酶是由多種復(fù)合酶系組成，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3種酶相互協(xié)同作用于纖維素，并將其降解[7-8]。纖維素酶主要來自細(xì)菌與絲狀真菌，細(xì)菌由于產(chǎn)酶不多且多產(chǎn)在胞內(nèi)故較少作為纖維素酶生產(chǎn)菌[9]，霉菌產(chǎn)生的菌絲能進(jìn)入纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之中，分泌的纖維素酶能由內(nèi)而外地降解纖維素，降解能力較強(qiáng)[10]。目前已發(fā)現(xiàn)有多種微生物菌屬有纖維素降解功能，其中包括木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)等菌株[11-12]。關(guān)于產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選目前也有很多，田云等[13]從蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)中獲得1株高產(chǎn)纖維素酶的肉座菌株(Hypocrealessp.)真菌，李曉秀等[14]從土壤中篩選獲得1株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，曾思泉等[15]從紅樹林根際土壤中獲得一株枝孢屬菌(Cladosporiumsp.)等。目前工業(yè)用產(chǎn)纖維素酶菌株主要為真菌，并多集中在木霉屬菌株[16]，其他高產(chǎn)纖維素酶真菌也具有很好的研究潛力。

本研究從樹林腐殖質(zhì)土壤中分離篩選出3株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，以分離獲得的3株菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，為纖維素酶應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

土壤取自自貢市附近樹林腐爛樹木和腐質(zhì)土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[17]：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，溶于去離子水1 000 mL。

分離培養(yǎng)基[18]：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂20 g，溶解至1 000 mL去離子水中。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[19](g)：CMC-Na 10，蛋白胨3.0，酵母膏0.2，(NH4)2SO42.0，KH2PO44.0，MgSO4·7H2O 0.3 g， 溶于1 000 mL去離子水中。

秸稈培養(yǎng)基：油菜秸稈粉10 g，蛋白胨3.0 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去離子水1 000 mL。

1.1.3 試劑及藥品

檸檬酸鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 4.8)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4等藥品均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 儀器與設(shè)備

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；phs-3C酸度計(jì)、YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)、HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造；V-1000可見分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離和初篩

取10 g土壤樣品，溶解于已滅菌的100 mL蒸餾水中，放入搖床28 ℃、180 r/min振蕩30 min進(jìn)行富集培養(yǎng)。取出靜置10 min后在超凈工作臺(tái)內(nèi)取上清液1 mL梯度稀釋到10-1～10-6，吸取10-4、10-5、10-6各0.2 mL涂布于分離培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，選擇生長(zhǎng)旺盛的菌株轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直到得到純培養(yǎng)進(jìn)行初篩[18]。

將得到純培養(yǎng)的菌株以三點(diǎn)法用牙簽點(diǎn)種到分離培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)3 d，用1 mg/mL 剛果紅溶液倒入平板染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，測(cè)定菌落直徑與透明圈直徑，篩選出直徑比大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[19]。

1.2.2 菌株復(fù)篩

將菌株接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，先將菌液紗布過濾再8 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定。

羥甲基纖維素酶(CMC酶)活測(cè)定：在25 mL比色管中加入1.5 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的CMC溶液，再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，在50 ℃ 下反應(yīng)30 min，取出后加入1.5 mLDNS溶液，空白管加入0.5 mL 粗酶液迅速沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。

濾紙酶(FPA酶)活測(cè)定：將重50 mg的濾紙(長(zhǎng)6 cm、寬1 cm)折成M形裝入25 mL比色管中，加入1.5 mL pH為4.8的磷酸緩沖液，再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，50 ℃下反應(yīng)60 min，取出后加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液迅速沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。酶活定義：在一定條件下，1 mL 粗酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株在CMC培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d后觀察菌落形態(tài)特征，挑取少量菌體涂于載玻片在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

分子鑒定：將菌株在種子培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)36 h， 使用真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。將提取得到的DNA作為模板，用真菌18S rDNA通用引物ITS1：(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS2：(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：I5Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，dH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度94 ℃，5 min；變性：98 ℃，10 s；退火：53 ℃，15 s；延伸：72 ℃，10 s；循環(huán)數(shù)：35；總延伸：72 ℃， 5 min；4 ℃保持。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行序列同源性比對(duì)，選擇同源性高的序列用MEGA 6.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌株種屬。

1.2.4 菌株利用秸稈產(chǎn)酶及秸稈降解率

將菌株培養(yǎng)好的種子液接種到秸稈培養(yǎng)基中，在28 ℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，然后測(cè)定CMC、FPA酶活。同時(shí)在培養(yǎng)的第3天、第6天時(shí)測(cè)定秸稈降解率。測(cè)定方法為使用濾紙過濾發(fā)酵液，將濾渣在烘箱內(nèi)80 ℃烘干至恒重，用失重法計(jì)算油菜秸稈失重率[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離與初篩

將樣品土壤稀釋液涂布于以CMC-Na為唯一碳源的分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，一共分離純化出23株菌株，通過進(jìn)一步點(diǎn)種于分離培養(yǎng)基，剛果紅染色后測(cè)定透明圈直徑與菌落比，篩選出8株透明圈菌落比值較大的菌株，其中菌株B03透明圈與菌落直徑比最大達(dá)到2.53±0.23(圖1)，詳見表1。

圖1 菌株B03剛果紅染色的透明圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle by Congo red staining of strain B03

2.2 菌株酶活測(cè)定

將分離得到的透明圈與菌落直徑比較大的菌株接種到種子培養(yǎng)基，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)2 d后以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃條件下發(fā)酵3 d后取發(fā)酵液紗布過濾后于8 000 r/min條件下離心10 min得上清液測(cè)定酶活。結(jié)果顯示，菌株B03的CMC酶活最高，達(dá)到(427.62±2.78)U/mL，F(xiàn)PA酶活也較高為(46.83±1.85)U/mL。菌株D11、E15 CMC酶活力也較高，將此3株菌作為后續(xù)研究對(duì)象。結(jié)果詳見表1。

表1 菌株透明圈與菌落直徑比和酶活Table 1 The diameter ratios of the transparent ring to the colony and enzyme activity

2.3 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株B03、D11和E15于CMC分離培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)4 d后，觀察菌株菌落形態(tài)。結(jié)果表明，3株菌的菌落形態(tài)相似，顏色均為灰綠色，菌落平鋪狀表面有絨毛狀菌絲，為圓形或橢圓形。顯微鏡下3株菌株形態(tài)也相似，分身孢子梗端生或者側(cè)生于菌絲，孢子梗直長(zhǎng)少有彎曲，在其頂端產(chǎn)生孢子鏈，分身孢子為卵圓形(圖2)。根據(jù)《中國(guó)真菌志》，菌株B03、D11和E15依據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為枝孢屬(Cladosporiumsp.)。

圖2 菌株形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristic of strain

2.3.2 分子鑒定

利用試劑盒提取獲得的3株菌株基因組DNA，以提取得到的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行18S rDNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上與已有微生物18S rDNA序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明3株菌株與枝孢菌屬有較高的同源性，達(dá)99%。選擇與菌株同源性較高的菌株下載其18S rDNA基因序列，使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終鑒定篩選所得菌株B03、E15為枝孢菌(Cladosporiumsp.)，D11為極細(xì)枝孢菌(Cladosporiumtenuissimum)，如圖3、圖4所示。

圖3 菌株電泳圖Fig.3 The DNA and PCR fragments of strains

圖4 菌株的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains based on the 18S rDNA sequence

2.4 菌株利用秸稈產(chǎn)酶及秸稈降解率

將菌株在以油菜秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，然后濾紙過濾取濾液，8 000 r/min離心10 min得粗酶液，按照1.2.2中方法測(cè)定CMC、FPA酶活。在同樣培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)了3、6 d的發(fā)酵過濾殘?jiān)?，?0 ℃下烘干至恒重，以失重法計(jì)算油菜秸稈的降解率。由表2可知，3株菌株以油菜秸稈為底物發(fā)酵產(chǎn)酶能力比以CMC為底物時(shí)低，可能是由于油菜秸稈成分復(fù)雜，菌株不能完全利用其所有成分物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力有一定降低，但酶活力依然保持較高。培養(yǎng)6 d后秸稈降解率均達(dá)到20%及以上，B03達(dá)26.80%，對(duì)油菜秸稈粉均有較好的降解效果。

表2 菌株酶活力和秸稈降解率Table 2 Enzyme activity and the degradation rate of straw of strains

3 討論

土壤中富含大量微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等，腐殖土中含有較多木質(zhì)纖維素，是自然富集產(chǎn)纖維素酶菌株的地方。目前關(guān)于產(chǎn)纖維素酶真菌的研究多集中于木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)等，關(guān)于枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道較少[16]。枝孢菌在自然界中分布廣泛，具有耐壓、耐熱等生理特性[21]，大多數(shù)已知的枝孢菌的模式菌為植物寄生或腐生菌，枝孢菌的生活方式?jīng)Q定了其具有分解木質(zhì)纖維素的能力[22]。

本研究從腐質(zhì)土壤樣品中，利用剛果紅染色初篩、酶活復(fù)篩篩選獲得3株高產(chǎn)纖維素酶真菌，通過顯微鏡形態(tài)特征觀察及分子生物學(xué)鑒定，該3株菌均屬于枝孢菌屬。3株菌中B03菌株以CMC為底物產(chǎn)酶CMC酶活達(dá)(427.62±2.78)U/mL，F(xiàn)PA酶活為(46.83±1.85)U/mL，其CMC酶活顯著高于田云等[13]、陳麗燕等[23]報(bào)道的菌株。在以油菜秸稈為底物產(chǎn)酶時(shí)CMC酶活也有(352.50±4.17)U/mL，F(xiàn)PA酶活為(35.67±1.85)U/mL，以油菜秸稈粉為底物時(shí)產(chǎn)酶能力雖不如以CMC為底物時(shí)高，但其CMC酶活還是具有較高酶活，高于柴秀娟等[17]報(bào)道的酶活。在培養(yǎng)6 d后油菜秸稈降解率達(dá)26.8%，因測(cè)定時(shí)有菌體生長(zhǎng)影響，故實(shí)際分解率應(yīng)大于測(cè)定值。據(jù)報(bào)道，枝孢菌還有產(chǎn)木質(zhì)素酶的能力[24]，后續(xù)還可研究其木質(zhì)素酶能力。

綜上本研究獲得高產(chǎn)纖維素酶真菌是1株高產(chǎn)CMC酶的枝孢菌，所產(chǎn)CMC酶活力較高，同時(shí)也能以油菜秸稈為底物產(chǎn)酶，對(duì)油菜秸稈具有較好的分解率，是1株具有較高研究?jī)r(jià)值的菌株。