馮殿鵬 劉廣慧 韓卿

[摘要]目的 探討MG-132對TRAIL誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS凋亡的影響。方法 骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為單用TRAIL組、單用MG-132組、聯(lián)合組。在應(yīng)用上述三種給藥方案24 h后，分別對誘導(dǎo)MG-132細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行檢測;計算細(xì)胞抑制率;光鏡下觀察細(xì)胞變化。結(jié)果 單用TRAIL組誘導(dǎo)凋亡效果并不理想，隨著TRAIL濃度的升高，骨腫瘤U-2 OS凋亡率不斷升高，單用MG-132組細(xì)胞隨著給藥的濃度增加，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;聯(lián)合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細(xì)胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組骨肉瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著時間的推移，細(xì)胞抑制率上升，而聯(lián)合組的抑制率明顯高于TRAIL組和MG-132組，在72 h處達(dá)到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 單用TRAIL可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想。聯(lián)合MG-132使用后，可大大提高TRAIL誘導(dǎo)U-2 OS凋亡的效果。

[關(guān)鍵詞]蛋白酶體通路;TRAIL;骨肉瘤;凋亡

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（b）-0012-05

MG-132是蛋白酶體的阻斷試劑，阻斷后可使之失去活性[1]。泛肽-蛋白酶體（ubiquitin proteasome）是廣泛存在于真核細(xì)胞中，其能快速處理和降解蛋白質(zhì)的非溶酶體物質(zhì)，蛋白酶體是指有蛋白降解作用的酶復(fù)合體。MG132是一種肽醛，可以有效地阻斷蛋白酶體的蛋白水解活性，包含芐酯基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸序列[2]。據(jù)報道，蛋白酶體的抑制劑（包括MG132）可以通過形成活性氧（ROS）從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。蛋白酶體抑制劑引起的ROS的形成和谷胱甘肽（GSH）的耗竭可導(dǎo)致線粒體功能障礙和隨后細(xì)胞色素C的釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力的喪失[3-4]。在細(xì)胞質(zhì)中蛋白酶體亞群是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）表面、細(xì)胞骨架[5]、中心體相伴隨。大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的多種蛋白均有此通路降解[6]。

TRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）基因最早由Wiley等[7]在1995 年從人心肌cDNA 文庫中克隆得到并命名，1996 年P(guān)itti等[8]克隆到同樣的基因，并命名Apo22L。由于其氨基酸序列具有TNF超家族的結(jié)構(gòu)特征，并能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的人類B淋巴細(xì)胞凋亡，故命名為TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體。但是有研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡作用并不理想，這限制了TRAIL在抗腫瘤治療中的應(yīng)用[9]。本實驗基于TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，探討蛋白酶體通路等因素對于其治療效果的影響。

1資料與方法

1.1 一般資料

MG-132購自Cell Signaling公司;新西蘭新生牛血清購自Sigma-Aldrich公司;胰蛋白酶、四氮唑藍(lán)（MTT）及雙抗購自Sigma-Aldrich公司;Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自Ambion 公司;骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS購自上海信然公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)方案? 骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后給藥。單用TRAIL組選用400、600、800、1000 μg/L 4種濃度;單用MG-132組選用5、10、15、20 μmol/L 4種濃度，聯(lián)合應(yīng)用組選用800 μg/L TRAIL以及15 μmol/L MG-132合用。在應(yīng)用上述3種給藥方案24 h后，分別對誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行檢測。

1.2.2 Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率? 實驗組給予400、600、800、1000 μg/L TRAIL，5、10、15、20 μmol/L MG-132以及聯(lián)合組，并設(shè)立空白對照組，24 h進(jìn)行檢測。用配備好的洗滌液洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞至1 ×106/ml，取100 μl 細(xì)胞（105cells）至5 ml管內(nèi)，加入5 μl 培養(yǎng)液混勻，室溫下避光培養(yǎng)20 min，每管加入400 μl 1×Binding Buffer，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)? 將1×106/ml細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁后加入不同濃度藥物細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔100 μl，每種濃度平行5孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl新配制的10 mg/ml的MTT，37℃繼續(xù)孵育分別于0、24、48、72 h，棄上清加150 μl DMSO溶解，混勻后在540 nm波長測定吸光度。 腫瘤細(xì)胞抑制率（%）= （1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.3 觀察指標(biāo)

于0、24、48、72 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞抑制率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

光鏡下可見單純應(yīng)用TRAIL及MG-132 分別作用于骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS后，隨時間推移，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)相應(yīng)變化，24 h后腫瘤細(xì)胞開始變小，48 h部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步變小并脫落，72 h后大多數(shù)腫瘤細(xì)胞脫落并聚集成團(tuán)塊。TRAIL和MG-132聯(lián)合作用時，上述現(xiàn)象更明顯（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞儀結(jié)果

2.2.1 單用TRAIL組流式細(xì)胞儀結(jié)果? 單用400、600、800、1000 μg/L TRAIL的細(xì)胞凋亡率分別為（5.7±1.0）%、（6.4±2.3）%、（7.1±2.5）%、（8.6±2.1）%，結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.2.2 單用MG-132組流式細(xì)胞儀結(jié)果? 單用5、10、15、20 μmol/L的MG-132細(xì)胞凋亡率分別為（6.9±1.5）%、（7.8±1.3）%、（8.5±2.1）%、（9.2±1.3）%，結(jié)果顯示，隨著給藥的濃度，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。

2.2.3 聯(lián)合組流式細(xì)胞儀結(jié)果? 空白對照組、單用800 μg/L TRAIL組、單用15 μmol/L MG-132組及聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.8±0.6）%、（7.1±2.5）%、（8.5±2.1）%、（9.8±1.2）%，不同用藥濃度，凋亡率也隨之變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

流式細(xì)胞儀結(jié)果的比較

聯(lián)合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細(xì)胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組骨肉瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 MTT測得抑制率結(jié)果

隨著時間的推移，細(xì)胞抑制率上升，而聯(lián)合組的抑制率明顯高于單用TRAIL組和MG-132組，在72 h處達(dá)到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

3討論

生物治療作為繼傳統(tǒng)腫瘤治療手段后的又一種治療方法，在腫瘤治療中越來越顯示出其特殊性及優(yōu)越性[10-11]。特別是對骨惡性腫瘤的治療，已有大量的基礎(chǔ)研究報告。TRAIL是1995年克隆的TNF超家族新成員，與其受體（TNF related apoptosis inducing ligand receptor，TRA ILR）相結(jié)合后能啟動細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但對部分腫瘤細(xì)胞的作用不敏感[12-14]。

MG-132是泛素-蛋白酶體的阻斷劑，能有效阻斷多種調(diào)節(jié)蛋白的降解，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用。有研究認(rèn)為蛋白質(zhì)的泛肽化與包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的許多細(xì)胞活動過程有關(guān)[15-17]。

近來有研究發(fā)現(xiàn)，泛肽-蛋白酶體通路可能參與了多種凋亡調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的降解，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著非常重要的作用。Soldalenkov等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)泛肽-蛋白酶體阻斷后會引起某些細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。推測：在TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中存在某些調(diào)節(jié)蛋白，可大大提高TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用，而這些調(diào)節(jié)蛋白很大可能是由蛋白酶體通路所降解，阻斷凋亡的傳單，增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL的抵抗性。泛肽-蛋白酶體阻斷后，可在很大程度上保證這些調(diào)節(jié)蛋白的存在，大大提高TRAIL的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究著重探討泛素-蛋白酶體與TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間的相互關(guān)系。單一使用TRAIL誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS凋亡效果較差，聯(lián)合MG-132后抑制效果顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），顯示出一定的臨床應(yīng)用價值。目前臨床上治療腫瘤的傳統(tǒng)方法是手術(shù)、放療、化療相結(jié)合的方法，但對正常細(xì)胞有極大的殺傷作用，限制了其治療效果。TRAIL以其高效低毒的生物學(xué)特點(diǎn)，給腫瘤治療帶來了新的希望[19-20]。其內(nèi)在機(jī)制并未被完全闡釋清晰，仍需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，TRAIL可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想?；旌鲜褂肕G-132后，可大大提高TRAIL誘導(dǎo)U-2 OS凋亡的效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1]吳迪炯，徐瑾玉，葉寶東，等.苦參堿對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡及泛素蛋白酶體通路的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57（10）：874-878.

[2]劉桐宇.蛋白酶體抑制劑MG-132導(dǎo)致胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2007.

[3]Ling YH，Liebes L，Zou Y，et al.Reactive oxygen species generation and mitochondrial dysfunction in the apoptotic response to Bortezomib，a novel proteasome inhibitor，in human H460 non-small cell lung cancer cells[J].J Biol Chem，2003，278（36）：33 714-33 723.

[4]Qiu JH，Asai A，Chi S，et al.Proteasome inhibitors induce cytochrome c-caspase-3-like protease-mediated apoptosis in cultured cortical neurons[J].J Neurosci，2000，20（1）：259-265.

[5]Wojcik C，DeMartino GN.Intracellular localization of proteasomes[J].Int J Biochem Cell Biol，2003，35（5）：579-589.

[6]顧光華，孔祥.泛素蛋白酶體通路以及蛋白酶抑制劑對NF-κB信號通路作用的研究進(jìn)展[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2009，13（9）：114-116.

[7]Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity，1995，3（6）：673-682.

[8]Pitti RM，Marstem SA，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo22 Ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].J Bio Chem，1996，271（22）：12 687-12 690.

[9]Srivastava RK.TRAIL/Apo-2L：mechanisms and clinical app-lications in cancer[J].Neoplasia，2001，3（6）：535-546.

[10]張友會.如何發(fā)揮生物治療在腫瘤綜合治療中的作用[J].中華腫瘤雜志，2003，25（1）：101-102.

[11]陳季紅.生物治療對腫瘤晚期患者生存質(zhì)量改善的觀察[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，15（102）：34-35.

[12]Eggert A，Grotzer MA，Zuzak TJ，et al.Resistance to tumornecro factor -related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） -induced apoptosis in neurobastoma cells correlates with a loss of caspase-8 expression[J].Cancer Res，2001，61（4）：1314-1319.

[13]Shin EC，Ahn JM，Kim CH，et al.IFN-γ induces cell death in human hepatoma cells through a TRAIL/Death receptor-mediated apoptotic pathway[J].Int J Cancer，2001，93（2）：262-268.

[14]He Q，Huang Y，Sheikh MS.Proteasome inhibitor MG132 up regulates death receptor 5 and cooperates with Apo2-L/TRA-IL to induce apoptosis in Baxp roficient and deficient cells [J].Oncogene，2004，23（14）：2254-2558.

[15]Ciechanover A，Schwartz AL.The ubiquitin system：pathogenesis of human diseases and drug targeting[J].Biochim Biophys Acta，2004，1695（1-3）：3-17.

[16]Carlos Camp s，Vega Iranzo，Roy M Bremnes，et al.Anorexia-Cachexia syndrome in cancer： implications of the ubiquitin-proteasome pathway[J].Support Care Cancer，2006， 14（12）：1173-1183.

[17]Sayers TJ，Murphy WJ.Combining proteasome inhibition with TNF-related apoptosis-inducing ligand （Apo2L/TRAIL） for cancer therapy[J].Cancer Immunol Immunother，2006，55（1）：76-84.

[18]Soldatenkov VA，Dritschilo A.Apoptosis of Ewing′s sarcoma cells is accompanied by accumulation of ubiquitinated proteins [J].Cancer Res，1997，57（18）：3881-3885.

[19]張亞平.RNA干擾抑制人類骨肉瘤細(xì)胞U2OS中c-FLIP表達(dá)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡[J].昆明理工大學(xué)，2015，12.

[20]郭志蘭，車路陽，孫震曉，等.TRAIL抗腫瘤的優(yōu)化研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2017，28（2）：175-181.

（收稿日期：2018-09-19? 本文編輯：許俊琴）