張武元， 陸宇燕， 史靜聳， 朱磊， 李丕鵬*

(1.沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽110034； 2. 沈陽師范大學(xué)遼寧省生物進(jìn)化與多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110034；3.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽110034； 4. 中國科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類研究所，北京100044；5.中國科學(xué)院脊椎動(dòng)物演化與人類起源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100044； 6. 成都觀鳥會，成都610041)

峨眉髭蟾Leptobrachiumboringii(Liu， 1945)隸屬角蟾科Megophryidae擬髭蟾屬Leptobrachium(Zhengetal.，2008)，俗稱“胡子蛙”或“角怪”，中國特有種。由于棲息環(huán)境質(zhì)量下降，峨眉髭蟾的種群數(shù)量已經(jīng)非常稀少，世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄將其列為瀕危(EN)物種(Fei & Wu，2004；Fei & Ye，2016)。雄性成體峨眉髭蟾在每年2—4月的繁殖季節(jié)出現(xiàn)明顯的性二態(tài)特征：上頜有10～16枚平均長度為3～5 mm的錐形黑色角質(zhì)刺，前臂變粗壯，背部及大腿等部位的皮膚變厚、松弛(Zhengetal.，2010；樊均德等，2011)。研究認(rèn)為，雄性成體峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺是爭奪領(lǐng)地的格斗武器(Hudsonetal.，2010；Hudson & Fu，2013)，目前未見角質(zhì)刺組織學(xué)結(jié)構(gòu)的報(bào)道。本研究首次對峨眉髭蟾角質(zhì)刺進(jìn)行了組織學(xué)觀察，從而彌補(bǔ)了該物種獨(dú)特性二態(tài)的生物學(xué)資料，旨在豐富我國特有無尾兩棲類的組織學(xué)資料，為進(jìn)一步對兩棲動(dòng)物進(jìn)化、行為等方面關(guān)系的研究積累科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

2016年2月采自四川省峨眉山的3只雄性成體峨眉髭蟾(表1)，雙毀髓法處死后，10%中性福爾馬林溶液固定，每只隨機(jī)選取2枚大小相似的角質(zhì)刺，并將其底部相連接的上頜皮膚與上頜骨一同剪下，剪取的樣品約0.5 cm×0.5 cm，分別用于常規(guī)組織學(xué)觀察和表面結(jié)構(gòu)的亞顯微結(jié)構(gòu)觀察。常規(guī)石蠟切片之前，用一定濃度的HNO3溶液進(jìn)行脫鈣處理。切片厚度為7 μm，采用蘇木精-伊紅(HE)染色。利用Olympus BX51-DP71顯微鏡觀察和拍照，用Image-Pro Express 6.0測量單側(cè)角質(zhì)刺的厚度及表皮嵴長度等，采用SPSS 20處理數(shù)據(jù)。利用臺式電鏡HITACHI TM3030觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 角質(zhì)刺結(jié)構(gòu)

光鏡下，峨眉髭蟾的角質(zhì)刺整體呈倒“V”形(圖版Ⅰ：1)，與皮膚相連接的角質(zhì)刺單側(cè)厚度為145 μm±10 μm，并可見明暗相間的黑色斑狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ：2)。在高倍物鏡下可見角質(zhì)刺側(cè)壁由排列緊密的角質(zhì)化上皮細(xì)胞構(gòu)成(圖版Ⅰ：3)，這些上皮細(xì)胞由于胞質(zhì)著色深淺的差異形成了低倍鏡下明暗相間的條帶結(jié)構(gòu)。整體上，著色淺部分的上皮細(xì)胞胞核淡染，呈瘦弱的梭形；胞質(zhì)有一定的膨脹現(xiàn)象，著色極淺；細(xì)胞間質(zhì)明顯，呈強(qiáng)噬伊紅。角質(zhì)刺深染部分，胞核依稀可見，呈橢圓形；胞質(zhì)呈深棕色；界限基本清晰，細(xì)胞排列緊密(圖版Ⅰ：4)。在角質(zhì)刺內(nèi)側(cè)可清晰分辨皮膚的表皮層和真皮層，但在表皮和與角質(zhì)刺內(nèi)側(cè)的接觸面僅可見不同程度角質(zhì)化的細(xì)胞，未見其他結(jié)構(gòu)填充(圖版Ⅰ：5)。在角質(zhì)刺基部可見明顯的皮膚褶翻起將其包裹在內(nèi)(圖版Ⅰ：6)，并可見皮膚褶向上延伸形成的由單層立方上皮細(xì)胞構(gòu)成的外膜。但由于角質(zhì)刺較為堅(jiān)硬，這2種結(jié)構(gòu)在制片過程中大多被破壞而喪失(圖版Ⅰ：7)。

掃描電鏡下，角質(zhì)刺頂面觀(圖版Ⅱ：8)為錐形的“小山丘”狀，在其頂部尚可分辨出表皮細(xì)胞的輪廓，在其側(cè)面可見呈覆瓦狀排列的角質(zhì)化細(xì)胞出現(xiàn)層層堆積的特征(圖版Ⅱ：9)。在角質(zhì)刺和上頜皮膚交界處可見兩者結(jié)構(gòu)是一致的，均由多邊形的角質(zhì)化表皮細(xì)胞構(gòu)成，僅在角質(zhì)刺處出現(xiàn)隆起(圖版Ⅱ：10)。構(gòu)成角質(zhì)刺的表皮細(xì)胞的側(cè)緣具有數(shù)個(gè)指狀突起，與相鄰細(xì)胞之間形成良好的鑲嵌連接。而在表皮細(xì)胞的上、下表面上可見大量的突起或凹陷，呈現(xiàn)出凹凸不平的花紋結(jié)構(gòu)，即上、下層表皮細(xì)胞之間具有大量的鑲嵌連接(圖版Ⅱ：11)。

圖版Ⅰ 雄性峨眉髭蟾角質(zhì)刺的顯微結(jié)構(gòu)Plate Ⅰ Microstructure of the keratinized nuptial spines of male Leptobrachium boringii

圖版Ⅱ 峨眉髭蟾角質(zhì)刺的掃描電鏡圖Plate Ⅱ Scanning electron microscopy of the keratinized nuptial spines of Leptobrachium boringii

2.2 角質(zhì)刺處及其周邊的皮膚結(jié)構(gòu)

在倒“V”形角質(zhì)刺中央的凹陷處，上頜表皮隆起，與角質(zhì)刺緊密連接，形成了角質(zhì)刺的“基座”(圖版Ⅰ：1、7)。此處仍可區(qū)分表皮和真皮，表皮層由內(nèi)到外可以區(qū)分出生發(fā)層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層。生發(fā)層位于表皮最內(nèi)層，與真皮層連接，為1層矮柱狀細(xì)胞，排列緊密，胞質(zhì)弱酸性；胞核較大、橢圓形，多位于近細(xì)胞基底部，深染。棘細(xì)胞層細(xì)胞多為橢圓形、梭形或不規(guī)則形，胞質(zhì)著色略深，胞核趨向圓形，著色略變淺。顆粒層細(xì)胞多為梭形，胞質(zhì)嗜酸性逐漸增強(qiáng)；細(xì)胞核著色不一，逐漸變?yōu)樗笮?，橫位(圖版Ⅰ：5，圖版Ⅲ：12)。最外層為角質(zhì)層(圖版Ⅲ：13)，細(xì)胞層數(shù)1～3，胞質(zhì)為強(qiáng)嗜酸性，被染成深紅色，而胞核著色不明顯；角質(zhì)層下的表皮層由5～11層細(xì)胞組成；而在拱起的頂部表皮層多達(dá)10～13層細(xì)胞(圖版Ⅲ：14)。角質(zhì)刺側(cè)壁表皮層常有1～2個(gè)伸入到真皮層深處的表皮嵴(圖版Ⅲ：15)，其為表皮基底層細(xì)胞向真皮層的延伸。角質(zhì)刺內(nèi)的真皮層沒有典型的疏松層和致密層，纖維成分多呈多向性分布，其間夾雜著疏松結(jié)締組織(圖版Ⅲ：16、17)，可見毛細(xì)血管和色素細(xì)胞(圖版Ⅲ：18)，但未見皮膚腺。在角質(zhì)刺基部與上頜皮膚連接處以及其周邊皮膚結(jié)構(gòu)可見真皮層結(jié)構(gòu)的漸變過程，尤其是周邊皮膚的真皮致密層內(nèi)纖維呈束狀，并呈平行分布，而纖維束進(jìn)入角質(zhì)刺基部后呈發(fā)散狀，失去束狀形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(圖版Ⅲ：19)。

峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺周邊的皮膚均可分為典型的表皮層和真皮層，真皮層中疏松層與致密層清楚可辨，并可見大量皮膚腺體、色素細(xì)胞(圖版Ⅲ：20、21)。

圖版Ⅲ 峨眉髭蟾角質(zhì)刺處及其周邊皮膚的顯微結(jié)構(gòu)Plate Ⅲ Microstructure of the skin on and around the keratinized nuptial spines of Leptobrachium boringii

3 討論

3.1 峨眉髭蟾角質(zhì)刺的結(jié)構(gòu)特征

Liu(1945)依據(jù)峨眉髭蟾為模式種建立的髭蟾屬Vibrissaphora與擬髭蟾屬的最大區(qū)別是其雄性上頜長有角質(zhì)刺。但髭蟾屬的有效性存在爭議(Dubois，1980；Dubois & Ohler，1998)。形態(tài)學(xué)研究表明，髭蟾屬和擬髭蟾屬物種的成體極為相似，但髭蟾屬的雄性在繁殖季節(jié)上唇緣有黑色錐狀角質(zhì)刺，能顯著區(qū)別于擬髭蟾屬，故應(yīng)獨(dú)立為屬。因此，角質(zhì)刺也一直作為鑒定該屬物種重要的分類依據(jù)之一(劉承釗等，1980；費(fèi)梁等，1995)。而近年分子系統(tǒng)學(xué)研究認(rèn)為，之前基于形態(tài)訂立的髭蟾屬和擬髭蟾屬互相不成單系，建議把髭蟾屬并入擬髭蟾屬(Rao & Wilkinson，2008；Zhengetal.，2008；Matsuietal.，2010；Chenetal.，2013；Fei & Ye，2016)。

無尾兩棲類特有的第二性征是婚瘤，許多種類在繁殖期雄性拇指皮膚局部特化形成突起的婚墊，有些類群也在其他指和(或)胸部形成刺團(tuán)(Duellman & Trueb，1994；Lunaetal.，2012)。婚墊有3種形態(tài)結(jié)構(gòu)類型，其中1種具有婚刺，一般認(rèn)為構(gòu)成婚瘤的刺由表皮和真皮組成(Duellman & Trueb，1994；楊純，2004；Lunaetal.，2018)。但對分布于墨西哥到阿根廷的拉丁美洲雨蛙科Phyllomedusidae(原為雨蛙科Phyllumodesinae亞科)5屬26種婚墊的研究表明：婚刺細(xì)小，外部形態(tài)復(fù)雜多樣，由表皮層細(xì)胞突起構(gòu)成，且只有最外層表皮細(xì)胞角質(zhì)化，真皮層不參與刺的形成(Julianetal.，2010)。而峨眉髭蟾的角質(zhì)刺不僅大，由表皮和真皮組成，真皮深入刺的髓部形成錐狀突起的髓芯，且表皮的角質(zhì)化程度高，表皮細(xì)胞層數(shù)明顯多于其周邊皮膚的真皮細(xì)胞層數(shù)，從而形成強(qiáng)硬的大刺。此外，髭蟾角質(zhì)刺的數(shù)量、大小和形態(tài)特征具有種間差異，也是物種鑒別特征之一，這點(diǎn)和棘胸蛙Paaspinosa等的婚墊和(或)胸部刺團(tuán)相似(俞寶根，2010；費(fèi)梁等，2012)。

牛角是皮膚的同源器官，為圓錐形管狀填充結(jié)構(gòu)，主要由角質(zhì)外殼、內(nèi)部骨芯和連接兩者的軟組織層3部分組成(鄒猛等，2015；佘平昌，2016)。在白犀牛Ceratotheriumsimum鼻角觀察到寬度為5～6 cm周期性深淺不一的條帶狀結(jié)構(gòu)，而這些條帶正好與其年齡基本一致(Pienaaretal.，1991；Rachlow & Berger，1997；Hieronymusetal.，2006)。峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺無內(nèi)部骨芯支持，僅有隆起皮膚作為支撐，同時(shí)角質(zhì)刺處的表皮細(xì)胞角質(zhì)化堆積后直接形成了強(qiáng)大的角質(zhì)刺結(jié)構(gòu)，兩者之間未見其他的組織作為間接介質(zhì)，這與牛角結(jié)構(gòu)區(qū)別明顯。雄性成體峨眉髭蟾的角質(zhì)刺在繁殖季節(jié)后期逐個(gè)脫落，這與白犀牛的鼻角明顯不同。而峨眉髭蟾的繁殖季節(jié)是冬春接替的2月下旬至3月中旬，氣溫波動(dòng)較大，溫度變化直接影響了峨眉髭蟾的各項(xiàng)生理機(jī)能，包括皮膚的代謝功能和生長速度。而這種變化是否是導(dǎo)致峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺切面呈現(xiàn)規(guī)律的明暗相間結(jié)構(gòu)的成因還有待進(jìn)一步積累資料證明。

3.2 角質(zhì)刺結(jié)構(gòu)與功能的適應(yīng)性

在無尾兩棲類中，僅5%物種的雄性之間為競爭領(lǐng)地和配偶存在著直接格斗行為，但一般均以摔跤的形式進(jìn)行(Shine，1979；Wells，2007)。而性成熟的雄性峨眉髭蟾卻演化出了具有明顯格斗功能的第二性征——上頜角質(zhì)刺，且在繁殖季節(jié)能助力于領(lǐng)地和配偶的競爭。因此，Hudson等(2010)認(rèn)為峨眉髭蟾是研究無尾兩棲類動(dòng)物雄性格斗武器出現(xiàn)與第二性征之間演變關(guān)系的有效模型物種。

兩棲類皮膚比較特殊，不僅要完成動(dòng)物皮膚的基本功能，還在呼吸、生殖和防御等方面起重要作用(Dockray & Hopkins，1975；Sekietal.，1989，1995；Brodieetal.，1990；Hofer & Mokri，2000；Blaustein & Belden，2003；梁剛，王瓊霞，2004；劉滿櫻等，2007；曹燕等，2011；吳文英等，2011；雷飛宙等，2012；賈麗麗等，2013；高鳳娟等，2016)。與其他同類物種皮膚結(jié)構(gòu)一致，峨眉髭蟾上頜部由皮膚演化出來的角質(zhì)刺，在繁殖季節(jié)用于爭奪領(lǐng)地和交配權(quán)。當(dāng)1只沒有繁殖巢穴的雄性峨眉髭蟾接近1只有巢穴的雄性峨眉髭蟾并試圖侵占領(lǐng)地時(shí)，便會發(fā)生格斗行為。巢穴中的個(gè)體會嘗試將入侵者推出巢穴入口，而入侵者則會通過扭抱并旋轉(zhuǎn)對方來獲得領(lǐng)地。這個(gè)過程中，一旦1只雄性能用粗壯的前臂成功抱住對手的腰部，它便會用角質(zhì)刺反復(fù)刺擊對方的腹部，戰(zhàn)斗時(shí)間通常會持續(xù)2～5 min，直到有一方成功被驅(qū)趕至巢外。格斗行為對雙方均有傷害甚至由于格斗太過激烈而折斷角質(zhì)刺(Hudsonetal.，2010)。峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺用于雄性間的格斗，所以須承受巨大的沖擊力和牽拉力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，峨眉髭蟾上頜角質(zhì)刺很好地適應(yīng)了格斗需要。首先，角質(zhì)刺的核心由突起的皮膚構(gòu)成，且真皮部分以發(fā)散狀多向性分布排列的纖維成分分散于疏松結(jié)締組織中，即以軟組織很好地緩沖了來自外部的沖擊力；角質(zhì)刺基部由皮膚包裹更加鞏固了角質(zhì)刺與上頜皮膚的連接，角質(zhì)刺側(cè)壁表皮伸入真皮部分的表皮嵴加強(qiáng)了表皮與真皮連接的牢固性。而在以往研究中未見無尾兩棲類表皮嵴的報(bào)道(Penrose & Ohara，1973；Young，1977；王大江等，1991；Hanetal.，2010；徐平等，2012；邵華信，呂學(xué)洗，2014；王溯，陳曉蓉，2014)。另外，在角質(zhì)刺基部和周邊皮膚的真皮致密層的排列可以將角質(zhì)刺承受的沖擊力分散到周圍，減輕角質(zhì)刺的壓力，很好地保護(hù)了角質(zhì)刺的一定存在周期，有利于保持繁殖期間所需要的競爭力。

對黃牛Bostaurus角以及穿山甲Manispentadactyla鱗片拉伸斷口的亞顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞為角質(zhì)化的鱗片狀細(xì)胞層層堆積組成。這種層狀的堆積結(jié)構(gòu)在抵抗裂紋擴(kuò)展中發(fā)揮著很大的作用，可以使裂紋在擴(kuò)展過程中轉(zhuǎn)向，大大增加裂紋擴(kuò)展的路徑、能量，從而大幅度提高材料的斷裂韌性(馬云海等，2008；李炳蔚，2010；唐偉文，2015)。另外，峨眉髭蟾角質(zhì)刺的每個(gè)角質(zhì)化細(xì)胞上都具有凹凸不平的花紋結(jié)構(gòu)，這對于角質(zhì)刺的增韌也具有重要作用。首先，角質(zhì)化細(xì)胞表面凹凸不平的花紋可以加強(qiáng)微觀的摩擦自鎖，即界面粘結(jié)。又由于這些細(xì)胞之間存在的鑲嵌連接和橋粒結(jié)構(gòu)，當(dāng)其承受載荷時(shí)，橫向和縱向?yàn)閿?shù)眾多的角質(zhì)化細(xì)胞之間會相互作用，從而造成很大的抵抗破壞能力，可以抵抗外界來自不同方向的牽拉力，是一種有效的增韌機(jī)制。這使角質(zhì)刺在保持結(jié)構(gòu)完整性的基礎(chǔ)上，同時(shí)還具有良好的力學(xué)結(jié)構(gòu)，這種存在于無尾兩棲類的“格斗武器”也為今后仿生學(xué)提供了更多的資料。

致謝：感謝沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫琦等同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過程中的幫助，感謝峨眉山黃灣鄉(xiāng)大峨村村民駱玉泉在作者采集標(biāo)本過程中遇到生命危險(xiǎn)時(shí)提供的救援幫助。