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1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司，云南 昆明 650033

丹綠補腎膠囊是由白花丹、綠包藤、射干、胡椒和干姜五味藥組成的(傣藥)復(fù)方制劑，主要功效為補腎滋陰壯陽。用于陰陽兩虛所致陽痿遺精、腰膝酸軟和身體乏力[1]?，F(xiàn)行國家標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局局頒藥品標準WS-10436(ZD-0436)-2002-2012Z，其中鑒別項下包括白花丹、綠包藤、胡椒的薄層鑒別；含量項下包括胡椒堿含量測定。本次研究重新建立了丹綠補腎膠囊的薄層鑒別方法，增加射干薄層鑒別[2-6]，修訂了白花丹、綠包藤及胡椒薄層鑒別方法。且以上4個藥材的薄層鑒別采用同一供試品溶液即可完成；同時采用高效液相色譜法，增加次野鳶尾黃素的含量。實驗結(jié)果表明所用方法操作簡便、專屬性好、靈敏度高、快捷準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制，并且可完善和提高丹綠補腎膠囊的質(zhì)量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CPA225D型電子分析天平(德國賽多利斯)；HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；TDL-60B型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；國產(chǎn)薄層預(yù)制G板(青島海洋化工廠分廠)；國產(chǎn)薄層預(yù)制GF254板(青島海洋化工廠分廠)；瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼相機成像系統(tǒng)；安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 試藥 次野鳶尾黃素對照品(批號：111557-200602)、胡椒堿對照品(批號：110775-201405，純度98.9 %)、白花丹對照藥材(批號：121370-200401)、綠包藤對照藥材(批號：121371-200401)、射干對照藥材(批號：120994-201206)均購自中國食品藥品檢定研究院；丹綠補腎膠囊(批號：17041761、17041861、1704196，1云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司)；各陰性對照樣品根據(jù)處方及制法自制，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 白花丹的薄層色譜鑒別 取本品內(nèi)容物1 g，加甲醇5 mL，超聲提取30 min，過濾，濾液作為供試品溶液。另取白花丹對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部 通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱2 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。白花丹陰性對照無干擾，方法具專屬性。如圖1所示?！?/p>

2.1.2 綠包藤的薄層色譜鑒別 取綠包藤對照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部 通則0502)試驗，吸取鑒別(1)項下的供試品溶液5 μL、上述對照藥材溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶5∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。綠包藤陰性對照無干擾，方法具專屬性。如圖2所示。

2.1.3 射干的薄層色譜鑒別 取射干對照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部 通則0502)試驗，吸取鑒別(1)項下的供試品溶液及上述對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇(3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。射干陰性對照無干擾，方法具專屬性。如圖3所示。

2.1.4 胡椒的薄層色譜鑒別 取胡椒堿對照品，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部 通則0502)試驗，吸取鑒別(1)項下的供試品溶液及上述對照藥材溶液各2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(10∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。胡椒陰性對照無干擾，方法具專屬性。如圖4所示。

2.1.5 方法驗證 上述薄層鑒別均分別采用3 種來源不同的色譜板，分別在低溫(約7 ℃)、常溫(20～25℃)、高溫(30～35℃)、低濕度(相對濕度30 %)、高濕度(相對濕度75 %)進行考察，結(jié)果均獲得良好色譜分離效果。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸(41∶59)；檢測波長：266 nm；流速1 mL/min；柱溫為40℃；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取次野鳶尾黃素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含次野鳶尾黃素10 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取丹綠補腎膠囊內(nèi)容物0.35 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 按處方比例分別制備不含射干藥材的樣品，依照“2.2.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液10 μL，按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果表明陰性樣品在與供試品中次野鳶尾黃素相同的保留時間處無干擾峰。如圖5所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標，以進樣量為橫坐標進行線性回歸，得次野鳶尾黃素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=4257.1x+5.9621，r2=0.9999(n=6)。結(jié)果表明次野鳶尾黃素在1.097～32.91 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖6所示。

2.2.7 精密度試驗 取同一批號(批號17041761)的供試品溶液，連續(xù)進樣5次，每次進樣10 μL，按峰面積計算：次野鳶尾黃素相對標準偏差(RSD)為0.2%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號(批號17041761)的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL進行測定，按峰面積計算：次野鳶尾黃素的相對標準偏差(RSD)分別為1.6%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號17041761)，取0.175 g、0.35 g、0.525 g各3份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定。按含量計算：次野鳶尾黃素的相對標準偏差(RSD)分別為0.8%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的丹綠補腎膠囊(批號：17041761)內(nèi)容物9份，每份0.175 g，分成3組，每組分別精密加入相當于樣品中所含次野鳶尾黃素量的50%、100%、150%的對照品貯備液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.2.11 樣品含量測定 取3批樣品，每批平行取樣2份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，按外標一點法計算樣品中次野鳶尾黃素的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定 (n=2)

3 討論

3.1 薄層鑒別方法的優(yōu)化 射干藥材的薄層鑒別方法研究過程中參考《中國藥典》2015年版“射干”藥材[6]項下薄層鑒別方法，并對此方法進行了優(yōu)化，將聚酰胺薄膜更換為硅膠GF254薄層板，刪除“噴以三氯化鋁試液”步驟，將365 nm下檢視改為254 nm下檢視，使此方法更加簡便，易于操作。

原標準中[1]白花丹、綠包藤、胡椒的薄層鑒別分別為3個供試品溶液，且處理步驟復(fù)雜，處理時間較長，使用有機溶劑種類及數(shù)量較多。通過實驗摸索發(fā)現(xiàn)，以上3味藥材薄層色譜供試品溶液可與射干鑒別采用同一溶液，經(jīng)驗證，4個鑒別方法陰性均無干擾，方法耐用性好。本方法易于普及掌握，有效提高了檢測效率，降低了檢測成本，減少了環(huán)境污染。

3.2 含量測定方法選擇

3.2.1 提取溶劑的選擇 取同一批樣品(批號：17041761)適量，分別采用75%甲醇、甲醇、75%乙醇及乙醇為提取溶劑，同時超聲提取20 min進行考察，結(jié)果表明甲醇提取含量最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.2.2 提取方式的選擇 取同一批樣品(批號：17041761)適量，以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲、回流兩種方式進行提取，結(jié)果表明兩種方式含量基本一致，考慮到操作方便，因此選擇超聲提取。

3.2.3 提取時間的選擇 取同一供試品(批號：17041761)4份，以甲醇為提取溶劑，分別超聲10、20、30、40 min，按擬定色譜條件測定，結(jié)果表明超聲20 min之后含量基本相同，故選擇超聲20 min為提取時間。

3.2.4 波長的選擇 取一定濃度的對照品溶液，于190～400 nm下掃描，結(jié)果顯示次野鳶尾黃素在266 nm處有最大吸收，因此選擇266 nm作為檢測波長。

3.2.5 色譜條件的選擇 研究參考文獻方法[7-10]，分別考察了甲醇-水系統(tǒng)及乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)效果較好；又分別考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)，通過比較發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)效果較好，故本實驗最終選擇乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)。同時對色譜柱(Accrom XAqua C18、Welch Ultimate XB- C18、Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Kromasil 100-5 C18、Phenomenex Luna C18(2)、Accrom Unitary C18)、柱溫(25、30、35℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、酸度(0.1%、0.2%、0.3%磷酸水溶液)及流動相比例進行了耐用性考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜峰分離度受上述色譜條件影響不大，耐用性較好。為獲得最好的分離效果，最終確定了實驗所需色譜條件。

綜上，本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標準的基礎(chǔ)上增加了射干薄層鑒別，優(yōu)化了白花丹、綠包藤及胡椒的薄層鑒別方法，使得鑒別工作變得高效、環(huán)保；增加了射干中黃酮類有效成分次野鳶尾黃素的含量測定。試驗方法簡便快速，靈敏度高，專屬性強，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，提高完善了其質(zhì)量標準，可以作為本品的質(zhì)量控制方法,為丹綠補腎膠囊的全面質(zhì)量控制提供了新手段，以有效控制藥品質(zhì)量。