中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081

彝族“黃藥”的中藥名為艾納香，又稱為大風(fēng)艾、牛耳艾、大骨風(fēng)、冰片艾等，為菊科艾納香屬植物艾納香(BLumeabaLsamiferaDC.)全草[1]，主要分布在云南、貴州、廣西、廣東等地[2]。艾納香最早記載于公元741年陳藏器所編著的《本草拾遺》：“主癬避蛇”，由于療效確切，在歷代本草等相關(guān)文獻(xiàn)中均有關(guān)于艾納香用途、用法及療效等方面的記載[3]。艾納香以其全草或地上部分入藥，其性味苦、溫、辛，主要有祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、消腫止痛等功效[4]。彝醫(yī)認(rèn)為其性味苦，入脾、肺氣路，有清熱解毒、逐瘀化痰的功效，在中國西南彝族地區(qū)被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤，尤以抗肺癌效果為佳[5]。

文獻(xiàn)報(bào)道，艾納香的主要成分為黃酮和揮發(fā)油，同時(shí)也含有少量的苷類成分，其中黃酮類成分的研究最為廣泛。目前報(bào)道的黃酮類物質(zhì)主要為黃酮(醇)類、二氫黃酮類和查爾酮類三大類[6-10]。其藥理作用也主要集中在黃酮類物質(zhì)的作用上，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。為合理利用彝族“黃藥”艾納香植物中的黃酮類化合物，需要優(yōu)化對(duì)其進(jìn)行最大化提取分離的方法。目前已有學(xué)者對(duì)“黃藥”艾納香的總黃酮提取工藝和含量測(cè)定進(jìn)行了考察，黃永林等[14]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，對(duì)艾納香葉、小枝條、莖中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示葉中總黃酮含量最高為2.94%，小枝條含量最低只有1.21%。羅夫來等[15]用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量，以提取率為指標(biāo)，用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)選艾納香最佳提取工藝。和銀霞等[16]用超聲波提取方法考察了艾納香的提取工藝，并測(cè)定不同部位總黃酮的含量。課題組前期研究結(jié)果[17]表明，艾納香的黃酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在羅夫來等[15]研究基礎(chǔ)上考察了提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響，并利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選取乙酸乙酯萃取部位對(duì)彝族“黃藥”艾納香中總黃酮進(jìn)行考察，以期找到最佳的提取工藝，為更好地開發(fā)利用艾納香并發(fā)揮其藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AdventurerOHAUS電子天平，UV1700PC紫外可見分光光度計(jì)(上海鳳凰光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥材 “黃藥”為菊科艾納香屬植物艾納香的干燥莖、葉，購自河北安國藥材市場(chǎng)，經(jīng)DNA條形碼鑒定為真品。

1.3 試劑 蘆丁對(duì)照品(北京百靈威科技有限公司)。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。

2 方法

2.1 艾納香中總黃酮測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品15.1 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密 吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；10% AL(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；4% NaOH溶液10 mL，搖勻，靜置15 min，加水至相應(yīng)刻度。在510 nm處測(cè)定各溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明蘆丁在0.00604～0.04832 mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材2.0 g，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇按不同的料液比、不同的加熱時(shí)間以及不同加熱次數(shù)進(jìn)行回流提取，濾過，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液(濃度為1 mg/mL)待用。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 稱取艾納香藥材2.0 g，用80%的乙醇按料液比為15∶1加熱回流3次，每次3 h，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液待用。精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下處理，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算吸光度RSD值為0.515%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批艾納香藥材5份，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，其余的步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，結(jié)果吸光度值得RSD值為1.035%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2 mL供試品置于25 mL容量瓶中，其余步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法加顯色劑顯色進(jìn)行處理，分別在0、5、10、15、20、25、30 min測(cè)定其吸光度值，計(jì)算RSD值為0.5627%，樣品在30 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批艾納香藥材1.0 g，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密量取5份2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，分別加入0.151 mg/mL的蘆丁對(duì)照品2 mL，其余的步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，結(jié)果平均回收率為97.3%，RSD值為0.753%。

2.1.8 總黃酮的測(cè)定 取艾納香藥材按“2.1.3”制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算總黃酮的含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 對(duì)乙醇濃度設(shè)5個(gè)濃度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密稱取艾納香全草2.0 g，置于100 mL三角瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇 40 mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2 h，提取液過濾，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計(jì)算總黃酮含量和提取率。

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度小于 50% 時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率程增加趨勢(shì); 當(dāng)乙醇濃度為 50% 時(shí)，總黃酮提取率最高; 此后，再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，因此，確定乙醇濃度為 50% 左右較為合適。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 考察提取時(shí)間的影響，設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度，即0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。精密稱取2.0 g艾納香全草，置于100 mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40 mL，70 ℃ 水浴回流至規(guī)定時(shí)間，提取液過濾，共提取3次，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計(jì)算總黃酮含量和提取率。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間小于1.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮提取率程增加趨勢(shì)；當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h左右時(shí)，總黃酮提取率最高；此后，再延長提取時(shí)間，總黃酮提取率反而略微下降。因此，確定提取時(shí)間為1.5 h左右較為合適。

2.3 因素水平的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)研究選取影響艾納香回流提取的乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取次數(shù)(C)和提取時(shí)間(D)為考察因素，選用L9(34)正交試驗(yàn)表篩選最佳工藝。見表1。

表1 因素與水平

2.4 正交試驗(yàn) 取艾納香藥材2 g，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行提取，濾過，減壓濃縮得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，濃縮凍干成干粉。稱取相應(yīng)質(zhì)量的萃取物粉末，配置成供試品溶液，測(cè)定其吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算艾納香總黃酮百分含量。以該結(jié)果列入正交設(shè)計(jì)表中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

總黃酮提取率(%)=總黃酮的含量/藥材的重量

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由表2、3可知，各因素對(duì)提取率的影響依次為B>C>D>A，即料液比>提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇濃度。由此得到最佳提取工藝為A1B3C2D2，即乙醇的濃度為50%，加入16倍量的乙醇，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)3次。

表 3 方差分析結(jié)果

F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取3份艾納香藥材各2 g，按照上述優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的測(cè)定方法條件測(cè)定，計(jì)算艾納香藥材中總黃酮提取率。結(jié)果艾納香藥材中總黃酮的提取率分別為2.74%、2.81%、2.77%，平均值為2.77%，RSD值為1.27%。結(jié)果表明所選工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

測(cè)定黃酮含量目前最常用的方法是紫外-可見光分光光度法(比色法)，是被測(cè)物質(zhì)在適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后，在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的測(cè)定吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，從而對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法[18]?？傸S酮含量的測(cè)定往往采用蘆丁作對(duì)照品，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后，在510 nm處測(cè)定吸光度值[14]。

實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)總黃酮提取率影響量較大的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)為4個(gè)主要因數(shù)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化艾納香的總黃酮提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取次數(shù)對(duì)艾納香中總黃酮的提取影響最大，其次為乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比。最終優(yōu)選的工藝條件為采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5 h。該工藝驗(yàn)證，3次提取結(jié)果的總黃酮提取率RSD值為2.0%，說明該工藝重復(fù)性良好，且總黃酮提取量最大，因此確定為最佳提取條件，為后續(xù)的艾納香研究實(shí)驗(yàn)作為參考。隨著臨床研究的進(jìn)一步發(fā)展，艾納香中總黃酮的藥理作用及作用機(jī)制將進(jìn)一步被闡釋說明，本實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝將對(duì)彝族“黃藥”艾納香的深度開發(fā)利用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。