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(寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315048)

硫氰酸鹽又稱硫氰化物,包括硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸銨等,屬于高環(huán)境風(fēng)險產(chǎn)品。人體若過量攝入硫氰酸鹽,其在體內(nèi)會釋放氰根離子,引起人體急性毒性,從而表現(xiàn)出惡心、嘔吐、昏迷、器官功能衰竭等癥狀;硫氰酸鹽的慢性毒性主要是抑制碘的轉(zhuǎn)運和甲狀腺激素合成,引發(fā)甲狀腺疾病,影響胎兒和嬰幼兒大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[1]。研究表明,許多植物,尤其是十字花科類植物,含有大量的硫代葡萄糖甙(硫甙),硫甙在硫葡萄糖甙酶作用下可降解為硫氰酸鹽[2]。目前,關(guān)于單體硫氰酸鹽對生物體毒性研究較多[3-4],但富含硫氰酸鹽植物對生物體影響的報道較少[5-6],硫氰酸鹽的檢測方法研究集中在乳制品測定中,主要包括分光光度法、電位滴定法、毛細管電泳法和離子色譜法[7-12]等,至于蔬菜中硫氰酸鹽的檢測方法至今還未有任何報道。

高氯酸鹽是指高氯酸形成的鹽類,廣泛存在于自然界中,主要用作火箭燃料和煙火中的氧化劑和安全氣囊中的爆炸物,由于其水溶性、流動性強,具有高度的擴散性和持久性,易導(dǎo)致對水源、土壤等環(huán)境的長期污染,經(jīng)植物吸收富集后,可通過食物鏈進入人體[13-14]。高氯酸鹽是一種持久性的有毒化學(xué)物質(zhì),能被甲狀腺吸收,減少甲狀腺對碘的吸收,干擾人體甲狀腺的正常功能,從而影響大腦組織的發(fā)育,對胚胎、嬰幼兒和少年兒童的發(fā)育危害巨大[15]。目前已有關(guān)于水、土壤、乳制品、茶葉等中高氯酸鹽含量的相關(guān)報道[16-25],較少有蔬菜中的相關(guān)研究報道[26]。

目前,我國還沒有蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測的國家標準或行業(yè)標準,也沒有蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的限值規(guī)定以及蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽對人體健康的潛在風(fēng)險評估(尤其對于存在甲狀腺疾病的人群)。因此發(fā)展一種蔬菜中快速、高效、準確的硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測方法,對我國蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的正常生理濃度作全面普查,并在此基礎(chǔ)上制定不同類蔬菜中合理的限量標準具有重要意義。但是,目前氰酸鹽和高氯酸鹽的測定方法中,樣品前處理方法均較為復(fù)雜,前處理時間長,操作繁瑣。如離子色譜法測定乳制品中硫氰酸鹽含量前處理多為溶劑提取+固相萃取(SPE)柱凈化模式,由于乳粉樣品含有大量蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì),影響色譜柱的壽命,因而在提取后必須采用乙腈、乙酸等有機溶劑去除樣品中的蛋白質(zhì),過RP固相萃取柱去除樣品中的脂肪后再進行測定[7-10];離子交換高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉和雞肝中的高氯酸鹽,前處理采用乙酸溶液-乙腈提取,固相萃取柱凈化再進行測定[27]。

本文建立了以超聲輔助超純水提取,離心后直接過膜進樣分析的前處理技術(shù)和超強親水性色譜柱分離、中等濃度氫氧化鉀淋洗液洗脫的特定離子色譜條件下,同時測定蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的方法,以期為我國蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽檢測的國家標準或行業(yè)標準的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蔬菜(西藍花、五號菜、菠菜、青菜、包心菜、大白菜)和蔬菜干制品(萬年青、蘿卜干) 購于寧波市清水橋菜市場;KOH淋洗液 色譜純,美國戴安公司;超純水 實驗室自制;1000 mg/L硫氰酸鹽(SCN)標準品 美國o2si smart solutions公司;1000 mg/L高氯酸鹽(ClO4) 美國Inorganic Ventures公司。

AQUION離子色譜儀 美國戴安公司,配有淋洗液自動發(fā)生裝置、電導(dǎo)檢測器、抑制器;Milli-Q Reference超純水儀 美國MILLIPORE公司;KS300EI超聲波清洗器 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;ME204E電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;JYL-C16V九陽料理機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將不同種類的新鮮蔬菜和蔬菜干制品采用九陽料理機精磨粉碎,分別取鮮樣10 g、干樣2 g于50 mL刻度離心管中,加超純水至20 mL,室溫下超聲(功率300 W)提取20 min,然后將獲得的超聲提取液在8000 r/min下離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜,上機待測[10,24]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:IonPac AS16分析柱,IonPac AG16保護柱;抑制器:ASRS-500e型抑制器,4 mm,外加水抑制模式;抑制電流:161 mA;柱溫:30 ℃;淋洗液:KOH溶液,梯度洗脫;淋洗液流速:1.0 mL/min;進樣體積:100 μL;梯度洗脫條件見表1[10,25]。

表1 色譜柱梯度淋洗條件Table 1 The gradient elution conditions in the chromatographic column

1.2.3 標準曲線的繪制與檢出限 將硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準品用超純水稀釋,分別配制成0.2、0.5、1、2、5 mg/L和0.04、0.1、0.2、0.4、1 mg/L的混合標準溶液,在1.2.2 色譜條件下,將不同濃度的標準溶液依次進樣分析,測定相應(yīng)的色譜峰面積值,以硫氰酸鹽和高氯酸鹽的質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得到硫氰酸鹽和高氯酸鹽的線性方程及相關(guān)系數(shù),以信噪比S/N=3計算其檢出限。

1.2.4 方法回收率及重復(fù)性實驗 取6份包心菜樣品按1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下測定硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量,計算其相對標準偏差。

分別向包心菜樣品加入低、中、高3種不同濃度的硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準溶液,充分混勻,按1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下進行測定,計算樣品加標回收率。

1.2.5 實際樣品的測定 采用1.2.1 樣品前處理和1.2.2色譜條件下對市售8類蔬菜樣品進行測定,計算其硫氰酸鹽和高氯酸鹽的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液和色譜柱的選擇

陰離子交換色譜中,淋洗液一般為碳酸根和氫氧根,親脂性季銨烷功能基色譜柱比較適合于碳酸根淋洗液,親水性季銨烷醇功能基色譜柱則比較適合于氫氧根淋洗液,硫氰酸根和高氯酸根離子屬于高價、易極化和疏水性的陰離子,對固定相有較強的親和力,在普通的陰離子色譜柱上保留時間長,色譜峰較寬且拖尾,甚至不被洗脫,因此需要選擇親水性色譜柱。美國戴安公司常用的親水性色譜柱中,IonPac AS16陰離子色譜柱為超強親水性色譜柱,且其固定相上鍵合強親水性烷醇基季銨鹽對氫氧根的親和力較強,使用中等濃度的氫氧根淋洗液即可達到易極化陰離子的快速分離,并且峰型尖銳對稱[28]。因此,選用的淋洗液為KOH溶液,色譜柱為IonPac AS16陰離子色譜柱。

2.2 標準曲線與檢出限

以硫氰酸鹽和高氯酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,標準溶液色譜圖如圖1所示,得到硫氰酸鹽在0.2～5.0 mg/L線性范圍內(nèi)的線性方程為Y=1.6637X-0.0876,相關(guān)系數(shù)r=0.9997,高氯酸鹽在0.04～1.00 mg/L線性范圍內(nèi)的線性方程為Y=0.8629X-0.0036,相關(guān)系數(shù)r=0.9989,表明兩種物質(zhì)的峰面積與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好;以信噪比S/N=3計算檢出限,硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢出限分別為0.005、0.008 mg/L。

圖1 硫氰酸鹽和高氯酸鹽標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of thiocyanate and perchlorate standard solution注:峰1：硫氰酸鹽；峰2；高氯酸鹽。

2.3 方法回收率及重復(fù)性實驗

樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的離子色譜圖見圖2,計算結(jié)果的相對標準偏差和平均加標回收率分別見表2和表3。由表2和表3可知,硫氰酸鹽和高氯酸鹽相對標準偏差分別為1.6%和6.9%,表明該方法重復(fù)性較好;硫氰酸鹽和高氯酸鹽的平均加標回收率分別在89.9%～98.4%之間和81.2%～94.4%之間,表明該方法準確度較高。

圖2 樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽色譜圖Fig.2 Chromatograms of thiocyanate and perchloratein in the sample注:峰1：硫氰酸鹽；峰2；高氯酸鹽。

表2 包心菜樣品中硫氰酸鹽 和高氯酸鹽含量及精密度(n=6)Table 2 Thiocyanate and perchlorate content and precision(RSD)in the cabbage samples(n=6)

表3 包心菜樣品中硫氰酸鹽 和高氯酸鹽的平均加標回收率(n=6)Table 3 Standard addition recoveries of thiocyanate and perchlorate in the cabbage samples(n=6)

2.4 實際樣品測定

采用本方法對8類蔬菜樣品進行檢測。由表4可知,檢測樣品中均含有一定量的硫氰酸鹽和高氯酸鹽,含量分別在2.869～32.35和0.057～1.417 mg/kg范圍內(nèi),其中蘿卜干含量最高,干制蔬菜的硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量明顯高于新鮮蔬菜,這可能是由于新鮮蔬菜含水量較高的緣故。

表4 樣品中硫氰酸鹽和高氯酸鹽含量(n=3)Table 4 Thiocyanate and perchlorate content in the samples(n=3)

由于人體每天對蔬菜的攝入量較大,《中國居民膳食指南》推薦正常成年人每人每天蔬菜攝入量為300～500 g,世界衛(wèi)生組織推薦標準為每人每天攝入量不應(yīng)少于400 g。目前,我國還沒有蔬菜中正常生理濃度的硫氰酸鹽和高氯酸鹽限值規(guī)定,歐洲食品安全局(EFSA)設(shè)定高氯酸鹽的每日容許攝入量(TDI)為0.3 μg/kg體質(zhì)量,如果以60 kg正常成年人每天攝入蔬菜量400 g計算,6類新鮮蔬菜高氯酸鹽平均含量為0.098 mg/kg,高氯酸鹽的攝入量為 0.65 μg/kg體質(zhì)量,已超過了EFSA設(shè)定的限值。由于本實驗所選的8類蔬菜無法完全代表居民正常的每天蔬菜攝入量,同時蔬菜中還含有較高的硫氰酸鹽,因此蔬菜中的硫氰酸鹽和高氯酸鹽對人體健康風(fēng)險需要更深入的研究和評估。

3 結(jié)論

本文建立了同時分析蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法,重點簡化了以超聲輔助超純水提取、離心后直接過膜分析的前處理技術(shù)以及采用超強親水性色譜柱分離、中等濃度氫氧化鉀淋洗液洗脫的快速分離技術(shù),本方法硫氰酸鹽和高氯酸鹽分別在0.2～5.0和0.04～1.00 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9997和0.9989,檢出限分別為0.005、0.008 mg/L,方法回收率分別為89.9%～98.4%和81.2%～94.4%,分析方法準確可靠、靈敏度高,可滿足同時測定蔬菜中硫氰酸鹽和高氯酸鹽的檢測要求。