夏海燕，周思多，張明喆，方 晗，黃 藝，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

酢辣椒是四川、湖北、湖南和貴州等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，多為農(nóng)家自制，其口味獨(dú)特，在當(dāng)?shù)貜V受人們的喜愛(ài)。制作酢辣椒的原料及方法各有不同，但大多數(shù)是由辣椒粉、米粉或是玉米粉，加水拌和入壇自然發(fā)酵而成[1]。研究表明，自然發(fā)酵的酢辣椒中存在大量乳酸菌[2]，不同地區(qū)酢辣椒產(chǎn)品中乳酸菌群組成各異[3-4]，包括植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳鏈球菌、醋酸桿菌、發(fā)酵乳桿菌等。乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生乳酸、醋酸、醇、醛、酮等物質(zhì)，對(duì)酢辣椒風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)地等起重要作用[2]。同時(shí)，乳酸菌還可以黏附于腸上皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群，減少胃腸道感染和炎癥性腸病以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等[5-7]。

目前對(duì)酢辣椒中乳酸菌資源的研究主要集中在菌種的篩選以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化[2,8]，對(duì)于其中可能具有益生屬性的乳酸菌研究較少。從其他發(fā)酵食品中分離得到的植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和醋酸桿菌等顯示出良好的益生屬性，表現(xiàn)為產(chǎn)酸能力強(qiáng)、胃腸環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、能有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和免疫功能[9]。作為益生菌，發(fā)揮益生特性的前提是進(jìn)入人體腸道并在其中定植，所以在篩選益生菌時(shí)需要注意考察乳酸菌對(duì)酸性環(huán)境、腸道環(huán)境的耐受能力。同時(shí)益生菌的腸道黏附能力，抑制病原菌能力和抗氧化能力等其他功能性特性也尤為重要[10]。

綜上所述，酢辣椒是益生菌的天然來(lái)源，但是對(duì)于酢辣椒中具有益生特性的乳酸菌在體內(nèi)發(fā)揮益生作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的酢辣椒為研究對(duì)象，分離得到16 株乳酸菌，以產(chǎn)酸能力和模擬胃液耐受能力為指標(biāo)進(jìn)行初篩，得到4 株具有潛在益生功能的乳酸菌，通過(guò)研究菌株對(duì)工藝逆境的耐受能力、菌株的疏水性和自聚合能力、菌株發(fā)酵液的抗菌和抗氧化能力等，最終得到3 株具有益生特性的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酢辣椒采自貴州劍河縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，在4 ℃轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室備用。

MRS培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司；API 50 CHL培養(yǎng)基 法國(guó)生物梅里埃公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；AIPHAPPHOT-2 YS2光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；PB-10 pH儀 德國(guó)Sartorius公司；Mastercycle聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Eppendorf公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 酢辣椒中益生乳酸菌的分離

取酢辣椒樣品25 g裝入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，搖勻后梯度稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取平板上具有較大溶鈣圈的菌落，進(jìn)行分離純化。通過(guò)革蘭氏染色和過(guò)氧化氫接觸酶實(shí)驗(yàn)篩選出符合乳酸菌菌株。

1.3.2 益生乳酸菌的篩選

1.3.2.1 產(chǎn)酸性能測(cè)定

將二次活化的菌株接種2%到MRS液體培養(yǎng)基中。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)量菌液的pH值和總酸?？偹岬臏y(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[11]。

1.3.2.2 人工消化液耐受性實(shí)驗(yàn)

人工模擬胃液配制[12]：胃蛋白酶（比活力3 000 U/mg）溶于0.5 g/100 mL NaCl溶液中，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2.0，終質(zhì)量濃度為0.27 mg/mL；人工模擬腸液配制：胰蛋白酶溶于0.5 g/100 mL NaCl溶液，添加0.3%膽鹽并用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，終質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，上述所有溶液過(guò)0.22 μm濾膜除菌。

實(shí)驗(yàn)方法：菌株在連續(xù)傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定期后取1 mL加入9 mL的模擬胃液或腸液中，混合均勻后37 ℃培養(yǎng)3 h。傾注平板法測(cè)定菌株經(jīng)胃液和腸液處理前后的活菌數(shù)，根據(jù)式（1）計(jì)算存活率：

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

初步分析菌種生理特征，結(jié)合糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)試劑條（API試劑條）進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）-溶菌酶法提取菌株DNA。16S rDNA擴(kuò)增采用通用引物，27F和1492R。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，此步驟共進(jìn)行29 個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送去生工生物工程（上海）公司測(cè)序。將所得序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，并用Clustal X軟件和MEGA（version 6.06）軟件進(jìn)行相似性分析，從GenBank菌株中選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而分析菌株間的親緣關(guān)系。

1.3.4 篩選菌株對(duì)工藝逆境的耐受特性

1.3.4.1 熱的耐受力

將菌株在60 ℃水浴條件下處理5 min，對(duì)比處理前后活菌數(shù)，按式（2）計(jì)算存活率：

1.3.4.2 溶菌酶的耐受能力

將活化好的菌株細(xì)胞用含有100 mg/L溶菌酶的MRS液體培養(yǎng)基重懸，對(duì)比培養(yǎng)0、30、90 min的活菌數(shù)。

1.3.4.3 0.4%苯酚的耐受能力

將活化好的菌株接種到0.4%苯酚的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。將0 h和24 h的系列稀釋液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.5 篩選菌株的表面疏水性和自聚合能力

1.3.5.1 表面疏水性

按照Ding Wurong等[13]方法將乳酸菌細(xì)胞懸浮液分別與正十六烷、氯仿和乙酸乙酯混合，靜置分層，在600 nm波長(zhǎng)處記錄水相的吸光度。根據(jù)式（3）計(jì)算細(xì)胞表面疏水性：

式中：A0和At分別為試劑萃取前、后水相在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5.2 自聚合能力

參照Shekh等[14]的方法測(cè)定自聚合能力。觀察乳酸菌細(xì)胞懸浮液在37 ℃放置0、2、4、24 h，在600 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。根據(jù)式（4）計(jì)算自聚合能力：

式中：At為t時(shí)刻的吸光度；A0為t為0時(shí)的吸光度。

1.3.6 篩選菌株的抗菌活性測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定菌株對(duì)3 種病原菌（大腸桿菌K12、銅綠假單胞菌PAO1、金黃色葡萄球菌ATCC6538）的抑制作用。上清液做3 種方式處理，分別為用1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.0，用過(guò)氧化氫酶處理和胰蛋白酶處理，然后過(guò)濾滅菌。加入準(zhǔn)備好的病原菌平板上的牛津杯中，將平板于4 ℃放置4 h，直到上清液擴(kuò)散到瓊脂中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑（mm）。

1.3.7 篩選菌株的抗氧化能力測(cè)定

將二次活化的菌株發(fā)酵上清液作為實(shí)驗(yàn)樣品溶液，根據(jù)Xiao Yu等[15]描述的方法分析菌株的體外抗氧化能力。

1.3.7.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

取樣品溶液2 mL與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合，避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處讀取樣品溶液和DPPH溶液的吸光度。

式中：A對(duì)照為DPPH溶液的吸光度；A樣品為樣品溶液存在下的吸光度。

1.3.7.2 清除2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基能力的測(cè)定

將1 mL樣品溶液與4 mL ABTS的乙醇溶液混合，室溫反應(yīng)6 min后測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

式中：A對(duì)照為沒(méi)有樣品溶液的吸光度；A樣品為樣品溶液存在下的吸光度。

1.3.7.3 亞鐵離子還原力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）測(cè)定

將1 mL樣品與5 mL FRAP試劑混合，37 ℃反應(yīng)20 min，在593 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。配制100～1 600 μmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，以FeSO4代替樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.600 8x-0.010 5（R=0.999 6），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的FeSO4當(dāng)量濃度。FRAP越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.8 篩選菌株的膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性和產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能力測(cè)定

1.3.8.1 BSH活性測(cè)定

在含有0.37 g/L CaCl2和5 g/L牛黃膽酸鈉的培養(yǎng)基中用接種環(huán)蘸取菌液劃線，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否形成一圈沉淀環(huán)。

1.3.8.2 乳酸菌產(chǎn)GABA能力測(cè)定

將菌株以2%接種于含1%谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基中，采用高效液相色譜法測(cè)定GABA的產(chǎn)量[16]。

1.3.9 安全評(píng)估

1.3.9.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

利用紙片法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)[17]，藥敏紙片種抗生素含量分別為紅霉素15 μg，鏈霉素10 μg，卡那霉素30 μg，壯觀霉素100 μg，四環(huán)素30 μg，環(huán)丙沙星5 μg，萬(wàn)古霉素30 μg，氯霉素和氨芐西林10 μg。

1.3.9.2 溶血活性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Foulquié Moreno[18]和Pieniz[10]等在血瓊脂平板上測(cè)試溶血活性。將菌株劃線至血瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，選擇金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.9.3 DNA酶活性測(cè)定

如Foulquié Moreno等[18]所述評(píng)估DNA酶活性。使用含甲苯胺藍(lán)的DNA酶瓊脂培養(yǎng)基接種菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將二次活化的菌株接種與平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酢辣椒中篩選菌株的產(chǎn)酸能力

對(duì)酢辣椒樣品進(jìn)行菌種分離，篩選出革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫接觸酶陰性的16 株乳酸菌純菌株。根據(jù)產(chǎn)酸速度，篩選出6 株產(chǎn)酸速度快的乳酸菌（圖1），編號(hào)為7-2、6-1、L3-4、L3-5、18-2和17-1。

圖1 6 株菌在MRS液體培養(yǎng)基的pH值和總酸變化Fig. 1 Changes in pH and total titratable acidity of six strains in MRS broth

如圖1所示，在MRS中生長(zhǎng)24 h后，6 株乳酸菌的pH值穩(wěn)定在4.0～4.4，總酸的范圍為1.28%～1.71%。pH值在發(fā)酵前10 h內(nèi)迅速下降，隨著菌株生長(zhǎng)到穩(wěn)定期而緩慢下降。所有菌株培養(yǎng)14 h都可進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，其中L3-5和17-1產(chǎn)酸最快，在培養(yǎng)4 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。研究表明，總酸和pH值的變化率與乳酸菌的生長(zhǎng)性能密切相關(guān)[19]，甚至影響了它們的發(fā)酵特性[20]，且當(dāng)pH值低于5.5時(shí)，由乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑菌效果更好[21]。

2.2 菌株胃腸道耐受能力

表1 菌株在模擬胃、腸液中菌株的存活率Table 1 Survival rates of isolates in simulated gastrointestinal fl uids

從表1可知，6 株乳酸菌在pH 2.0的胃液環(huán)境下培養(yǎng)3 h后活菌數(shù)均有一定程度的下降。其中菌株18-2的存活率最高，達(dá)到58.95%（P＜0.05），其次是17-1（53.77%）、L3-4（41.42%）和L3-5（38.99%）。菌株7-2和6-1的存活率相對(duì)較低，分別為23.71%和26.86%，說(shuō)明其耐受胃液的能力較差。在模擬腸液消化3 h后菌株17-1（76.02%）存活率最高，其次是L3-5（73.12%）、18-2（72.57%）和7-2（68.10%）。乳酸菌在進(jìn)入人胃腸道內(nèi)，只有不被胃腸道環(huán)境抑制和消化[22]，在腸道中的定植[23]才能發(fā)揮其益生作用。綜上結(jié)果將菌株7-2、17-1、18-2和L3-5選定為潛在益生乳酸菌進(jìn)行下一步研究。

2.3 4 株潛在益生乳酸菌菌株的鑒定

API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)試劑條，檢驗(yàn)株菌對(duì)49 種碳源的利用能力，將對(duì)照作為陰性實(shí)驗(yàn)，底物被利用的反應(yīng)結(jié)果均為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表2，菌株7-2、L3-5、18-2和17-1分別可以利用24、8、14 種和13 種底物。將反應(yīng)結(jié)果輸入乳酸菌和相關(guān)細(xì)菌鑒定軟件中，依據(jù)梅里埃數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將7-2鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；L3-5鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；17-1和18-2鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

表2 API 50 CHL試劑條反應(yīng)結(jié)果Table 2 Results of API 50 CHL strip reaction

將菌株的16S rDNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序后，進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性高的序列用作參考序列。菌株7-2與植物乳桿菌屬模式菌株KC887524.1達(dá)到99%的同源性；L3-5與數(shù)據(jù)庫(kù)中短乳桿菌HM058973.1同源性達(dá)到99%；18-2和17-1則分別與發(fā)酵乳桿菌GU138568.1和AY929282.1達(dá)到100%和99%的同源性。結(jié)合形態(tài)學(xué)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定分離菌株7-2為植物乳桿菌，L3-5為短乳桿菌，18-2和17-1為發(fā)酵乳桿菌。

2.4 篩選菌株對(duì)工藝逆境的耐受特性

表3 乳酸菌對(duì)熱處理、溶菌酶的耐受力Table 3 Tolerance of strains to heat treatment and to lysozyme

表3表明，4 株菌經(jīng)過(guò)熱處理都有較高的存活率。其中菌株18-2具有較好的熱耐受力，其存活率達(dá)到94.24%（P＜0.05），其次是菌株L3-5和17-1，存活率分別為87.98%和82.43%。乳酸菌對(duì)熱的耐受力對(duì)于益生菌在食品和食品工業(yè)中的應(yīng)用具有積極的作用。

溶菌酶實(shí)驗(yàn)中，處理前后活菌數(shù)都沒(méi)有明顯下降（表3），說(shuō)明篩選菌株均對(duì)100 mg/mL質(zhì)量濃度的溶菌酶具有很好的耐受力。

表4 乳酸菌對(duì)0.4%苯酚的耐受力Table 4 Tolerance of strains to 0.4% phenol

從表4可以看出，菌株經(jīng)0.4%苯酚溶液處理前后活菌數(shù)沒(méi)有減少。苯酚是腸中芳香族氨基酸代謝的常見(jiàn)副產(chǎn)物，菌株對(duì)苯酚的抗性表明腸道條件下存活的能力[24]。結(jié)果表明篩選菌株可以抵抗腸道中苯酚的抑菌作用。

2.5 篩選菌株的疏水性和自聚合能力

圖2 菌株表面疏水性Fig. 2 Cell surface hydrophobicity of strains

如圖2所示，所有菌株對(duì)氯仿和乙酸乙酯顯示出更高的表面疏水性，在Shekh等[14]的研究中，溶劑類型的親和力與本研究相同，不同乳酸菌對(duì)氯仿的疏水性最高，而對(duì)正十六烷最低。菌株的腸道黏附能力是益生菌的重要特性。細(xì)菌表面疏水性和自聚合能力作為乳酸菌的表面特性，被用于間接評(píng)估益生菌的黏附能力[25-26]。菌株17-1、18-2和L3-5疏水性較高，表明其對(duì)腸道的黏附性可能較強(qiáng)。

由圖3可見(jiàn)，所有菌株具有較高的自聚合能力。接種2、4 h和24 h其自聚合能力范圍分別為6.8%～19.7%，7.2%～28.1%和48.4%～70.7%。其中發(fā)酵乳桿菌18-2（70.50%）和發(fā)酵乳桿菌17-1（70.67%）表現(xiàn)出更高的自集合能力。已有研究表明，菌株的自聚合能力對(duì)形成生物膜有重要影響，這有助于腸道定植以保護(hù)胃腸道中的菌株[14]。

圖3 分離菌株的自聚合能力Fig. 3 Auto-aggregation of selected strains

2.6 篩選菌株的抑菌作用

圖4 4 株乳酸菌對(duì)3 種指示菌的抑制作用Fig. 4 Inhibitory activities of four strains against three indicator strains

如圖4所示，4 株乳酸菌發(fā)酵上清液均能抑制大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌ATCC6538，不能抑制銅綠假單胞菌PAO1，這與Tulumoglu等[27]報(bào)道的結(jié)果一致。

表5 菌株的抑菌能力Table 5 Antimicrobial activity of isolates

由表5可知，菌株18-2、L3-5和17-1的抑菌能力更強(qiáng)，中和法排除有機(jī)酸和過(guò)氧化氫酶的作用、排除過(guò)氧化氫對(duì)指標(biāo)菌的抑菌作用后，用胰蛋白酶對(duì)4 個(gè)菌株發(fā)酵液進(jìn)行處理，結(jié)果抑菌效果有明顯降低，確定了抑菌物質(zhì)中含有具備蛋白質(zhì)性質(zhì)的細(xì)菌素[28]。乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)病原體的抑制能力具有潛在應(yīng)用價(jià)值，乳酸菌可以通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)來(lái)保持腸胃道平衡，進(jìn)而改善人類健康[14]。

2.7 篩選菌株的抗氧化活性

通過(guò)3 種不同的方法評(píng)估抗氧化活性，結(jié)果如表6所示，所有菌株都表現(xiàn)出一定的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，但是清除能力相差較大（P＜0.05）。其中L3-5、7-2和17-1具有較高的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力（分別為65.95%、56.91%和61.13%）。而這4 株菌清除DPPH自由基清除能力差異不是很明顯。FRAP法是通過(guò)測(cè)量樣品中的還原劑將三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）-Fe3+還原成TPTZ-Fe2+的能力來(lái)衡量樣品的抗氧化能力，結(jié)果表明菌株L3-5、7-2和17-1表現(xiàn)出較高抗氧化活性（565.55、571.61 μmol/L和547.22 μmol/L）。先前的報(bào)道證明乳酸菌的完整細(xì)胞在體內(nèi)具有抗氧化活性[29]。不同方法測(cè)定的抗氧化能力不同，可能是不同乳酸菌起抗氧化作用的活性物質(zhì)的不同，綜合比較，發(fā)酵乳桿菌17-1、植物乳桿菌7-2和短乳桿菌L3-5發(fā)酵上清液具有較好的抗氧化能力，其在腸道內(nèi)生長(zhǎng)期間能通過(guò)發(fā)揮抗氧化活性來(lái)減少食物和飼料中的氧化損傷[19]。

表6 菌株的抗氧化能力Table 6 Antioxidant activity of isolates

2.8 篩選菌株的BSH活性和產(chǎn)GABA能力

表7 菌株的產(chǎn)GABA能力和BSH活性Table 7 GABA production and BSH activity of isolates

表7列出了分離細(xì)菌的BSH活性，4 株菌菌落周圍都有沉淀環(huán)，說(shuō)明具有BSH活性，具有水解?；敲撗跄懰徕c鹽的能力。BSH可催化酰胺鍵的水解釋放游離氨基酸和游離膽汁酸[30]，這是胃腸道中非常重要的轉(zhuǎn)化。BSH活性對(duì)降低血清膽固醇也很重要[31]。此外，所有菌株都有產(chǎn)GABA的能力，其中菌株7-2的GABA產(chǎn)量較高，可達(dá)到142.67 mg/L。從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選食品級(jí)具有GABA生產(chǎn)能力的菌株，繼而將此菌株接種到合適的食品基質(zhì)中，生產(chǎn)功能性食品，一方面能夠發(fā)揮GABA的保健功效，另一方面，乳酸菌的益生功能也可以得到很好的體現(xiàn)[32]。

2.9 篩選菌株的安全性評(píng)估

從酢辣椒中分離出的可用作益生菌的菌株應(yīng)對(duì)其對(duì)人類健康的潛在不利影響進(jìn)行測(cè)試。抗生素抗性，溶血活性和DNA酶活性是分析菌株在發(fā)酵劑培養(yǎng)中安全使用的重要特征。

表8 菌株對(duì)不同抗生素的耐藥性Table 8 Resistance of LAB strains to different antibiotics

如表8所示，4 株菌對(duì)紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和萬(wàn)古霉素敏感性強(qiáng)，對(duì)四環(huán)素、氯霉素和氨芐青霉素均為中等敏感性和弱敏感性。18-2和17-1對(duì)卡那霉素敏感。而對(duì)壯觀霉素敏感的為菌株7-2和17-1。

抗生素是一種生理活性物質(zhì)，其抗菌活性主要表現(xiàn)在3 種現(xiàn)象：抗菌、殺菌和溶解[8]。對(duì)細(xì)菌的殺菌作用表現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的強(qiáng)氧化作用以及核酸和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的破壞。本研究中選擇的抗生素，環(huán)丙沙星是抑制細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制，萬(wàn)古霉素和氨芐青霉素屬于抑制細(xì)胞壁合成的抗生素類群，而紅霉素、鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、四環(huán)素和氯霉素是影響細(xì)菌DNA中的蛋白質(zhì)合成細(xì)菌細(xì)胞。兼性和專性異型發(fā)酵乳桿菌（L. plantarum和L. brevis）對(duì)萬(wàn)古霉素具有固有耐藥性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。益生菌的使用要避免耐藥基因的傳播，分離菌株需要進(jìn)一步的研究來(lái)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。如果抗性基因不能進(jìn)行轉(zhuǎn)移，益生菌品種即可以引進(jìn)市場(chǎng)[33]。

金黃色葡萄球菌周圍的瓊脂出現(xiàn)綠色圈，而實(shí)驗(yàn)菌株周圍的瓊脂未出現(xiàn)綠色圈，也未出現(xiàn)透明圈。具有透明溶血性圈的那些分離株是β-溶血性或完全溶血性的，綠色圈是α-溶血性或部分溶血性，只有非溶血性的乳酸菌可作為潛在的益生菌[34]，本實(shí)驗(yàn)中篩選菌株都不是溶血細(xì)菌。

4 株篩選菌株的DNA酶活性結(jié)果顯示，菌株均不是DNA酶生產(chǎn)者，所以篩選菌株用于食品發(fā)酵是安全的[12]。

3 結(jié) 論

本研究從酢辣椒中分離得到產(chǎn)酸速度快的6 株乳酸菌，再通過(guò)菌株的胃腸道耐受能力篩選出4 株乳酸菌，通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析方法鑒定，確定其中1 株為植物乳桿菌（L. plantarum），2 株為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum），1 株為短乳桿菌（L. brevis）。

通過(guò)菌株的益生特性研究及安全性評(píng)估，獲得3 株具有潛在價(jià)值的乳酸菌，即發(fā)酵乳桿菌17-1、短乳桿菌菌L3-5和發(fā)酵乳桿菌18-2，其對(duì)熱處理、0.4%苯酚及溶酶菌有較好的耐受能力，有較高的表面疏水性和自聚合能力，都有BSH活性和產(chǎn)GABA能力。菌株發(fā)酵上清液具有較強(qiáng)的抑菌能力和抗氧化能力。

研究表明，傳統(tǒng)酢辣椒是分離益生乳酸菌新的天然來(lái)源，該研究從中分離的3 株乳酸菌具有多種益生特性，可作為潛在的益生菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。