周楠楠，樓宵瑋，王 穎，潘道東，孫楊贏，黨亞麗，曹錦軒*

（浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

糟肉是我國的傳統(tǒng)特色食品，以其典型的糟鹵風(fēng)味著稱于世，廣泛受到浙江、上海、江蘇、廣東等各地區(qū)人民的喜好。糟肉一般以豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、禽蛋、水產(chǎn)品等為原料，經(jīng)過清洗、煮制后，低溫腌制，最后經(jīng)過干糟或者濕糟鹵汁進行糟制而成。糟鴨是糟肉中的代表性產(chǎn)品，色澤潔白，口感細膩，風(fēng)味濃郁。國內(nèi)糟鴨的加工主要有2 種常見工藝類型，其中干糟是將腌制的鴨肉采用干酒糟直接糟制而成，而濕糟是將腌制的鴨肉浸入由鴨湯和酒糟、黃酒萃取制得的糟鹵中浸泡制備。風(fēng)味主要包括氣味和滋味，作為食品的重要特性之一，滋味對產(chǎn)品的質(zhì)量和消費者購買量具有重要影響[1]。大量研究表明，鴨肉和鴨肉制品中主要非揮發(fā)性滋味物質(zhì)包括游離氨基酸、小肽、核苷酸等[2-3]。干糟和濕糟由于其不同的糟制方式，以及干糟和濕糟的糟制劑（酒糟和糟鹵）化合物種類、含量不同，糟制劑擴散速率不同，會形成不同的滋味。目前，有關(guān)糟鴨加工過程中的小分子滋味化合物的相關(guān)文獻較少，糟鴨滋味特征性化合物種類和含量并不清楚。

研究表明，基于1H核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)，可以同時檢測出樣品中的多種小分子代謝物[4]。Graham等[5]研究牛肉成熟過程中核苷酸和游離氨基酸的NMR信號變化，發(fā)現(xiàn)宰后21 d成熟過程中12 種氨基酸含量顯著升高。Castejón等[6]利用NMR分析宰后牛肉滲出液的代謝物含量，報道23 種不曾在肉制品中發(fā)現(xiàn)的化合物。Zanardi等[7]通過NMR識別輻照牛肉特有的代謝生化標示物主要有3 類：甘油、乳酸酯類和酪胺（或者p-取代酚類化合物）。與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和毛細管電泳質(zhì)譜相比，NMR技術(shù)能夠更快速地對目標物進行檢測[8]。因此，該項技術(shù)被認為是一種先進的高通量代謝組學(xué)分析方法[5,9]。Liu Chunli等[3]采用NMR技術(shù)快速測定鴨肉中的代謝物，包括氨基酸、羧酸、糖類、核苷酸。Chen Daian等[4]基于NMR技術(shù)系統(tǒng)闡明糟帶魚中的小分子營養(yǎng)化合物，主要為有機酸、氨基酸、醇類、糖類。這些被NMR鑒定出的小分子化合物不僅是產(chǎn)品加工和貯藏過程中代謝物，也是肉制品中重要的滋味物質(zhì)。然而，NMR技術(shù)能否適用于檢測糟鴨加工過程中的滋味物質(zhì)，仍缺乏相關(guān)研究。

鑒于此，本研究采用NMR技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計方法，分析糟鴨加工過程中的關(guān)鍵工序?qū)π》肿幼涛段镔|(zhì)含量的影響，以期闡明糟鴨產(chǎn)品的滋味形成機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番鴨（日齡105～110 d，體質(zhì)量（2 845±224）g），除去內(nèi)臟的冷鮮白條鴨購買自寧波市樂購超市；3 a陳黃酒糟 嵊州市崇仁東升酒廠。

重水（D2O，99.9%）、三甲基甲硅烷基丙酸（3-(trimethylsilyl) propionic-2,2,3,3-d4acid sodium salt，TSP） 美國CIL公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司；冷凍離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；真空離心濃縮機美國Labconco公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；AVIII 600 MHz NMR儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 糟鴨加工工藝

20 只番鴨洗凈，沿著胸膛肋骨中線一分為二，取10 個半胴體作為生鴨樣品。剩余30 個半胴體按照料液比1∶2（g/mL）加入自來水，煮至大約15 min，鴨肉能被筷子扎透，取出自然冷卻。鴨肉冷卻后，用3%精鹽抹勻，4 ℃低溫腌制12 h。鹽腌后取10 個半胴體作為鹽腌樣品，剩余20 個半胴體鴨肉分為2 組，一組用于制作干糟產(chǎn)品，另一組用于制作濕糟產(chǎn)品。

干糟產(chǎn)品糟制工藝：向酒糟中加入3%精鹽拌勻，揉搓成團待用。陶罐底部鋪上一層酒糟，罩上一層透氣性良好的紗布，碼一層鴨肉，交替碼酒糟和鴨肉，酒糟和鴨肉質(zhì)量比為1∶1，最上層以酒糟塞住瓶口，封上保鮮膜和陶罐蓋。

濕糟產(chǎn)品糟制工藝：將酒糟和黃酒完全拌勻至沒有結(jié)塊為止，酒糟和黃酒料液比1∶1（g/mL）。糟酒混合物壓濾，所得汁液為糟露。煮制坯料的湯汁撇去浮油，過濾待用。糟露、鴨肉湯汁、精鹽、味精、醬油混勻即成糟鹵，其中糟露10 L、鴨湯200 L、鹽0.3 kg、味精0.03 kg、醬油0.13 L。將冷卻后的鹽腌鴨坯平鋪于陶罐中，倒入糟鹵使其高過肉面，封上保鮮膜和陶罐蓋。

將干糟和濕糟產(chǎn)品的陶罐置于4 ℃，共糟制7 d得成品，分別各取10 只生鮮樣品、鹽腌鴨肉、干糟成品、濕糟成品為樣本，重復(fù)數(shù)為10 個。選取鴨胸肉樣品為測試對象，剔出胸肉，用錫箔紙包好，于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 代謝化合物的提取

傳統(tǒng)金融信用評估模型雖然可以在信用風(fēng)險評估中具有一定評估作用，但是大數(shù)據(jù)的出現(xiàn)導(dǎo)致其數(shù)據(jù)出現(xiàn)了更多的信息維度。除了交易結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)本身，還有大量的其他類型數(shù)據(jù)，如：企業(yè)水電數(shù)據(jù)、企業(yè)高管人員數(shù)據(jù)、相關(guān)企業(yè)信息數(shù)據(jù)等，上述數(shù)據(jù)均不兼容于傳統(tǒng)評估模型，導(dǎo)致最終信息出入較大，所以必須設(shè)計新的金融信用評估模型。這就需要利用大數(shù)據(jù)下的信用評估分析，原理如圖1所示。

稱取0.4 g鴨胸肉樣品，加入1 mL的甲醇-水（2∶1，V/V）混合液和1 g研磨珠于帶蓋破碎管中。在組織均質(zhì)儀上以4 260 r/min破碎30 s，冰浴30 s，共重復(fù)5 次。取出后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)加入甲醇溶液，破碎，離心。合并2 次離心所得的上清液，利用離心濃縮機除去有機溶劑后冷凍干燥。冷凍干燥后所得的代謝物重懸于550 μL Na+/K+緩沖液（0.15 mol/L，含有0.015% TSP和50% D2O，pH 7.4），4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，取500 μL上清液于5 mm NMR核磁管中待檢。每種樣品做10 次重復(fù)實驗。

1.3.3 NMR分析

樣品1D1H NMR譜采集，在配備有超低溫探頭的Bruker AVIII 600 MHz NMR儀上完成，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz，實驗溫度為298 K。譜寬為δ20，等待時間為2 s，混合時間為80 ms，90°脈寬為18 μs，采樣時間為1.36 s，采樣點數(shù)為32 K，F(xiàn)ID累加次數(shù)為32 次。

采用1D1H NMR譜上出峰較強的樣品，分別檢測1H J，1H-1H COSY，1H-1H TOCSY，1H-13C HMBC和1H-13C HSQ這一系列的2D NMR譜，從而對1D1H NMR譜上的信號進行歸屬。操作方法和相關(guān)參數(shù)參考課題組先前的實驗方法[3]。各代謝物的指認根據(jù)與The Metabolomics Innovation Centre數(shù)據(jù)庫比對來確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對1H NMR譜，使用TOPSPIN軟件進行手動定內(nèi)標和調(diào)平基線，使用AMIX軟件將樣品1H NMR譜從δ9.0～0.8按δ0.004分段進行積分，除去水峰（δ5.17～4.75）以及甲醇峰（δ3.38～3.35）所在化學(xué)位移區(qū)域。數(shù)據(jù)歸一化處理后，導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件進行多元統(tǒng)計分析，進行主成分分析（principal component analysis，PCA）圖和正交偏最小方差判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。所有的OPLS-DA模型采用CV-ANOVA進行檢驗[9]，P＜0.05，差異顯著。代謝物的相關(guān)系數(shù)圖使用MATLAB 7.1軟件所得。代謝物含量測定，根據(jù)其非重疊信號峰面積與已知濃度內(nèi)標TSP比值計算，具體計算公式和過程參考Dai Hui等[10]的方法。

不同工藝點各代謝物含量，采用SAS 8.0中one-way ANOVA的Duncan's multiple range test模型進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H NMR分析

圖1為生鴨肉（A）、干糟產(chǎn)品（C）和酒糟（E）的1H NMR圖譜。2D NMR譜對代謝物的信號歸屬結(jié)果如表1所示。本實驗中檢測到鴨肉和糟制劑中的代謝物共34 種，包括15 種氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、焦谷氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、?；撬帷⒏拾彼?、酪氨酸、苯丙氨酸）、6 種有機酸（乳酸、乙酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、甲酸）、2 種糖（葡萄糖、麥芽糖）、6 種核苷酸及其衍生物（尿嘧啶、尿苷、胞苷酸（5′-cytidine monophosphate，5′-CMP）、次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸（5′-inosinate，5′-IMP））、2 種醇（乙醇、2,3-丁二醇）、3 種堿（膽堿、甜菜堿、甘油磷酸膽堿）。大部分物質(zhì)在關(guān)于鴨肉代謝物和糟帶魚代謝物的研究中已有報道[3-4]。

圖1 生鴨肉（A）、干糟產(chǎn)品（C）和酒糟（E）的1H NMR譜圖Fig. 1 Representative 1H NMR spectra of metabolites extracts from raw duck (A), dry vinasse-cured duck (C) and vinasse (E)

表1 鴨肉和酒糟的NMR信號歸屬Table 1 NMR data of metabolites detected in vinasse-cured duck and vinasse

2.2 PCA結(jié)果

圖2 糟鴨加工過程中代謝物的主成分分析圖Fig. 2 PCA plot for metabolites of vinasse-cured duck during processing

2.3 糟鴨加工過程中代謝物的變化

OPLS-DA模型的準確性采用R2X和Q2評估，CV-ANOVA的結(jié)果用p值體現(xiàn)。這3 個數(shù)值均體現(xiàn)組間結(jié)果的顯著性和模型可信度。本研究中，相關(guān)系數(shù)大于0.602被認為存在顯著差異。向上的峰代表在后者樣品中該代謝物的含量高于前者，反之亦然。系數(shù)圖中代謝物峰的顏色越紅，代表兩者之間的差異越顯著。

如圖3所示，在煮制、鹽腌過程中，鴨肉中的琥珀酸、肌酸酐、膽堿、次黃嘌呤含量升高，而氨基酸、乳酸、肌酸、甘油磷酰膽堿、糖類、肌苷、5′-IMP含量下降。在干糟過程中，鴨肉中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機堿、糖類、肌苷含量升高，而肌酸、肌酸酐含量下降。在濕糟過程中，鴨肉中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機堿、葡萄糖含量上升，而乳酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、麥芽糖、5′-IMP含量下降。和干糟產(chǎn)品相比，濕糟產(chǎn)品的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、有機堿、葡萄糖含量較高，而乳酸、琥珀酸、肌酸、肌酸酐、麥芽糖、5′-IMP含量較低。

如表2所示，鴨肉中含量最高的物質(zhì)為天冬氨酸、乳酸、肌酸、葡萄糖和5′-IMP。Chen Daian等[4]在糟帶魚中同樣測定出含量最高的物質(zhì)為乳酸、肌酸和葡萄糖。除琥珀酸、肌酸酐、膽堿、次黃嘌呤外，大多數(shù)代謝物的含量在煮制鹽腌過程中下降（P＜0.05）。糟制過程促使糟鴨中的氨基酸、醇類、甲酸、乙酸、甘油磷酸膽堿、葡萄糖含量上升（P＜0.05），但使其他酸類含量下降（P＜0.05）。濕糟比干糟對糟鴨滋味含量變化影響更顯著（P＜0.05），這可能是因為濕糟滲透比干糟遷移速率更快。糟鴨中代謝物含量結(jié)果與OPLS-DA結(jié)果一致。

圖3 生鴨肉和鹽腌鴨肉（a）、鹽腌鴨肉和干糟產(chǎn)品（b）、鹽腌鴨肉和濕糟產(chǎn)品（c）、干糟產(chǎn)品和濕糟產(chǎn)品（d）的正交偏最小方差判別分析Fig. 3 OPLS-DA results generated by comparisons of spectra between raw duck and salted duck (a), salted duck and dry vinasse-cured duck (b),salted duck and wet vinasse-cured duck (c), and dry and wet vinasse-cured duck (d), respectively

表2顯示，酒糟和糟鹵中含有大量與糟鴨產(chǎn)品滋味物質(zhì)相同的代謝物，如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、乙醇、乳酸、葡萄糖等。這些物質(zhì)在糟制過程中能夠通過擴散作用滲透進鴨肉中，形成糟鴨的特征滋味。此外，由于酒糟是黃酒釀造后留下的殘渣以及黃酒生產(chǎn)中的發(fā)酵劑，酒糟中會殘留多種黃酒發(fā)酵所需的微生物，如酵母、真菌和細菌[11]。這些微生物可能在糟制過程中發(fā)揮作用，分泌特定的酶，從而影響糟鴨中代謝物的變化。

根據(jù)OPLS-DA和定量分析的結(jié)果，幾乎所有的氨基酸含量在煮制鹽腌過程中下降，糟制過程中上升。此結(jié)果與鹽水鴨加工過程中游離氨基酸的報道[12]一致，鹽水鴨在鹽腌和煮制過程中，游離氨基酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢。Dai Yan等[13]研究同樣顯示，南京鹽水鴨在經(jīng)過熱處理后，其游離氨基酸含量也會減少。但是，在板鴨加工過程中氨基酸變化研究中，鹽腌促使游離氨基酸含量的增加，可能原因是加工工藝的差異以及游離氨基酸含量在煮制過程中劇烈下降。

在煮制和鹽腌過程中，鴨肉中的游離氨基酸會參與反應(yīng)，生成揮發(fā)性風(fēng)味化合物或者降解成其他物質(zhì)[14]，與揮發(fā)性化合物變化的結(jié)果一致。對于酒糟中含有的氨基酸，糟鴨在糟制后均有顯著升高，因此，這些氨基酸可能來源是糟制劑[15]。對于酒糟中未被檢出的氨基酸，糟鴨在糟制過程中這些物質(zhì)含量的升高可能歸因于鴨肉中殘留的內(nèi)源蛋白酶以及酒糟中真菌和細菌分泌的蛋白水解酶[16-17]。糟鴨中含量最高的游離氨基酸是丙氨酸（干糟產(chǎn)品：0.38 mg/g；濕糟產(chǎn)品：0.31 mg/g）、天冬氨酸（干糟產(chǎn)品：2.06 mg/g；濕糟產(chǎn)品：3.15 mg/g）、牛磺酸（干糟產(chǎn)品：0.95 mg/g；濕糟產(chǎn)品：1.03 mg/g）、甘氨酸（干糟產(chǎn)品：0.28 mg/g；濕糟產(chǎn)品：0.31 mg/g），其中丙氨酸和甘氨酸呈甜味[18]，天冬氨酸呈鮮味[19]。糟鴨中的苦味氨基酸，比如亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等[20]，其呈味作用可以被糖、鹽等物質(zhì)抑制[21]。通過比較滋味閾值[22]可知，天冬氨酸對糟鴨的鮮味貢獻較大。

表2 糟鴨加工過程中代謝物含量及OPLS-DA相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coef fi cients from OPLS-DA and metabolite contents in vinasse-cured duck extracts at different sampling time points

酒糟和糟鹵中含有大量的葡萄糖[23]。此外，糟制劑中含有釀酒酵母和芽孢桿菌可以分泌淀粉酶和葡聚糖酶等[11]。因此葡萄糖的增加可能來源于糟制劑，以及糟制過程中多糖的分解[24]。麥芽糖在干糟和濕糟過程中含量降低，可能是因為糟制劑中殘留的麥芽糖酶將其發(fā)酵分解成葡萄糖[25]。代謝物中醇類和酸類的變化與碳水化合物發(fā)酵有關(guān)[26]。有研究報道，酒的發(fā)酵劑中含有大量的釀酒酵母和乳酸桿菌[27]。這些化合物會參與發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸，而后再代謝成醇類和酸類[4]。乙酸、甲酸、乙醇、2,3-丁二醇在糟制期間含量升高，主要源于糟制劑滲透和微生物發(fā)酵[28]。此外，肌酸和肌酸酐含量的下降有可能是分解生成精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸[29]。

肌苷和磷酸構(gòu)成5′-IMP，次黃嘌呤和核糖構(gòu)成肌苷[30]。在煮制鹽腌過程中，5′-IMP和肌苷含量下降，次黃嘌呤含量上升，說明5′-IMP和肌苷降解生成次黃嘌呤[31]。在糟制過程中，5′-IMP和肌苷進一步降解生成次黃嘌呤。上述變化說明糟鴨加工過程中與核苷酸有關(guān)的鮮味物質(zhì)顯著下降。

3 結(jié) 論

本研究采用NMR檢測糟鴨、糟制劑中的滋味成分，共測出34 種物質(zhì)，包括14 種氨基酸、7 種有機酸、2 種糖、6 種核苷酸及其衍生物、2 種醇、3 種堿。糟鴨加工過程中，氨基酸、醇類、堿類、糖類含量在煮制、鹽腌過程中下降，糟制過程中上升。甲酸、次黃嘌呤持續(xù)升高，而乳酸、肌酸、5′-IMP和肌苷含量則持續(xù)下降。濕糟比干糟過程對滋味化合物含量的影響更顯著。糟鴨加工過程中的代謝物含量變化與蛋白質(zhì)、多糖降解，滋味物質(zhì)滲透以及糟制劑中殘存微生物和酶作用有關(guān)。