范琳琳，王 英，程先玲，高 鵬，周劍忠,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇惠田農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 211414）

黑莓果實(shí)富含花色苷等多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)血管、減緩衰老等作用[1-4]。由于黑莓組織嬌嫩，水分含量高，不易貯藏，通常以果汁、果酒、蜜餞等加工產(chǎn)品食用。其果汁產(chǎn)品最大程度保留其汁液營養(yǎng)成分，是理想的加工產(chǎn)品。目前，黑莓果汁加工領(lǐng)域仍存在出汁率低、貯藏過程容易產(chǎn)生沉淀分層、渾濁等問題[5]。因此，提高黑莓果汁，尤其是清汁出汁效率和果汁品質(zhì)，仍是黑莓深加工業(yè)要解決的重要問題。

黑莓果實(shí)含有豐富的果膠和纖維素，果漿黏度高，不易出汁。研究表明，采用酶解技術(shù)條件反應(yīng)溫和，可以大大提高果汁的出汁率，尤其果膠酶和果漿酶復(fù)合使用，能夠加速汁液的流出，并可以有效控制懸浮顆粒，提高果汁的穩(wěn)定性[6-9]。除酶作用之外，一些非傳統(tǒng)加工技術(shù)如微波、超聲波等由于其高效、環(huán)保不斷被應(yīng)用于食品原料的降解、制備等加工過程[11-12]。其中，基于空化效應(yīng)的超聲波輔助技術(shù)應(yīng)用于原料處理，可破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，加速內(nèi)容物的流出，提高原料的加工效率[13-15]。若將其與酶聯(lián)用，可能會(huì)出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，提高黑莓果汁的品質(zhì)。因此，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助酶解制備黑莓清汁的工藝條件，對(duì)優(yōu)化條件下黑莓果汁的品質(zhì)和貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)超聲波輔助酶作用的協(xié)同機(jī)理進(jìn)行探討，以期為黑莓果汁的綜合深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓（-20 ℃貯存） 江蘇惠田農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司；果膠酶（6×104U/g）、果漿酶（含纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，4×104U/g） 寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-2500E型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)儀器有限公司；UV-3802H紫外-可見分光光度儀 上海尤尼柯儀器有限公司；WSC-S測色色差計(jì) 上海精科科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；EVOLS10掃描電子顯微鏡 德國卡爾·蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 黑莓清汁的制備工藝

黑莓凍果4 ℃解凍→熱燙→冷卻→勻漿→酶解（果膠酶酶解、果漿酶酶解、復(fù)合酶酶解、超聲輔助酶解）→滅酶→離心→黑莓清汁

將冷凍保存的黑莓在4 ℃解凍10 h，蒸汽熱燙3 min，冷卻后勻漿，得到黑莓漿15 kg，備用。果膠酶和果漿酶按照1∶1比例組合成復(fù)合酶，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)用量加入到100 g黑莓漿中，超聲條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解結(jié)束后，加熱到90 ℃滅酶5 min，冷卻后于5 000 r/min離心15 min，取上清液，計(jì)算出汁率（式（1）），并以蒸餾水為參照，測定其在660 nm波長處的透光率。對(duì)照組（果膠酶、果漿酶、復(fù)合酶）進(jìn)行水浴實(shí)驗(yàn)，其他條件與超聲輔助酶解相同。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)黑莓清汁的制備工藝，設(shè)定超聲功率200 W、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間1.5 h、加酶量0.2%為固定條件，分別研究超聲功率（100、200、300、400 W）、酶解溫度（35、40、45、50 ℃）、酶解時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5 h）及加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）對(duì)出汁率和透光率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助酶解制備黑莓清汁的工藝條件。以出汁率和透光率為響應(yīng)值，以超聲功率、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量4 個(gè)因素為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，見表1，其中-1、0、1分別代表自變量的低、中、高3 個(gè)水平。3 次平行實(shí)驗(yàn)所得的平均值采用二次多項(xiàng)式模型分析，見式（2）：

式中：Y為響應(yīng)值；α0為常數(shù)項(xiàng)；αi、αii和αij分別為一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的回歸方程系數(shù)；Xi和Yj為自變量。F檢驗(yàn)和P值用于檢驗(yàn)回歸模型的顯著性。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface analysis

1.3.4 黑莓果汁品質(zhì)指標(biāo)測定

分別設(shè)置超聲輔助酶解組、果膠酶組、果漿酶組、復(fù)合酶組4 個(gè)處理組，對(duì)果汁的色度、花色苷含量、總酚含量、貯藏穩(wěn)定性等測定，進(jìn)行黑莓果汁品質(zhì)的評(píng)價(jià)。

色度：將適量樣品于5 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，用WSC-S測色色差計(jì)測定黑莓果汁的L*、a*、b*值。L*表示亮度，a*表示紅/綠，b*表示黃/藍(lán)。

花色苷含量：參照文獻(xiàn)[16-17]，分別配制pH 1.0緩沖液（將0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl以25∶67的比例配制）和pH 4.5緩沖液（將1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl與H2O以100∶60∶90的比例配制）。取2 個(gè)10 mL棕色容量瓶，加入1 mL蒸餾水，分別加入9 mL pH 1.0緩沖液和pH 4.5緩沖液，搖勻，放置2 h，分別測定510 nm和700 nm波長處的吸光度，作為對(duì)照組。測定樣品時(shí)，取1 mL果汁，操作同上?；ㄉ蘸繙y定見式（3）：

式中：A=（A510nm-A700nm）pH1.0-（A510nm-A700nm）pH4.5；Mr為矢車菊素-3-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量（449.2）；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（取26 900）；1為比色皿光程（1 cm）。

總酚含量：采用福林-酚法測定樣品的總酚含量，參照文獻(xiàn)[18]并適當(dāng)調(diào)整。用10.0 mL乙醇溶解0.500 0 g沒食子酸，定容至100 mL，分別移取0、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL到100 mL容量瓶中，用去離子水定容，沒食子酸質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150、250、500 mg/L。從上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1.0 mL加入到10 mL容量瓶中，分別加入1.5 mL去離子水，混合均勻；加入0.5 mL 1 mol/L福林-酚試劑，混合均勻；1 min之后，加入1.0 mL 20%碳酸鈉溶液，混合。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 ℃放置2 h后，在765 nm波長處測定吸光度。取黑莓果汁，稀釋到適宜質(zhì)量濃度。取1.0 mL稀釋后的黑莓汁，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品中總酚含量。

貯藏穩(wěn)定性：將不同處理?xiàng)l件得到的黑莓清汁在室溫見光條件下貯藏6 周，每1 周取樣。利用色差計(jì)測定其色度值（L*、a*、b*）的變化，比較分析超聲輔助酶解組、果膠酶組、果漿酶組、復(fù)合酶組果汁色澤的穩(wěn)定性。同時(shí)測定貯藏期間花色苷含量、總酚含量和透光率的變化。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

取適量黑莓果漿酶解、離心后的沉淀，真空冷凍干燥，將凍干樣品黏附在具有雙面導(dǎo)電性的鋁箔紙上，噴金鍍膜，加速電壓為10.0 kV，在掃描電子顯微鏡下觀察樣品的形貌，分析超聲協(xié)同酶解對(duì)黑莓果漿微觀結(jié)構(gòu)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品重復(fù)測定3 次，利用SPSS 18.0和Design-Expert V8.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可以看出，當(dāng)超聲功率達(dá)到200～400 W時(shí)，黑莓清汁的出汁率最大，而當(dāng)其大于300 W時(shí)，透光率有所降低，可能是較大功率的超聲波引起黑莓殘余組織的破壞，導(dǎo)致清汁出現(xiàn)渾濁。因此選定300 W為最佳處理功率。當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)，出汁率達(dá)到最大，此溫度下復(fù)合酶具有較高的酶活力，有利于底物的轉(zhuǎn)化，而且得到的果汁具有較好透光率。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，雖然得到的果汁有較高透光率，但花色苷可能會(huì)隨溫度升高而出現(xiàn)降解[19]。已有研究證明，超聲可能會(huì)引起水浴實(shí)際溫度高于設(shè)定值的“附加效應(yīng)”，逐漸升高的內(nèi)部溫度會(huì)引起果汁品質(zhì)發(fā)生變化[20]，且在提取過程中，酶與溫度的交互作用對(duì)花色苷影響較大[13]。因此，選擇45 ℃作為最優(yōu)酶解溫度。當(dāng)酶解時(shí)間為1.5～2.5 h，加酶量為0.2%～0.3%時(shí)，黑莓果漿的出汁率較高，清汁透光率較好，綜合考慮花色苷的損失程度及加工成本，選擇酶解時(shí)間1.5 h、加酶量0.2%作為最佳條件。

圖1 超聲功率、酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)黑莓清汁的出汁率和透光率的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic power, hydrolysis temperature, time and enzyme concentration on the yield and transmittance of blackberry juice

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

為有效考察超聲和酶解協(xié)同作用于黑莓果汁的效果，本試驗(yàn)分別以出汁率Y1和透光率Y2為響應(yīng)值，分析X1超聲功率、X2酶解時(shí)間、X3酶解溫度、X4加酶量對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸模擬方程分別為：Y1=78.61-0.44X1+0.99X2+3.13X3+4.16X4+1.4X1X2+0.27X1X3+1.71X1X4+3.98X2X3-0.91X2X4+2.26X3X4-0.13-2.384.2-4.452=63.46-0.082X1-0.47X2+1.71X3+3.07X4+1.9X1X2+0.023X1X3-0.32X1X4+1.41X2X3-0.15X2X4+3.29X3X4-2.24-2.55-1.74-5.5

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

從表3、4可以看出，所獲得的回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型有效，能夠較好地預(yù)測試驗(yàn)值。其中，酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)出汁率影響極顯著（P＜0.01），超聲功率對(duì)其影響不顯著。酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度的二次項(xiàng)影響極顯著（P＜0.01），說明這3 個(gè)因素對(duì)黑莓清汁的出汁率有極大影響。加酶量對(duì)透光率的影響極顯著，其他因素對(duì)透光率影響不大。

表3 回歸模型出汁率方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of response surface model for juice yield (Y1)

表4 回歸模型透光率方差分析Table 4 ANOVA of response surface model for transmittance (Y2)

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化結(jié)果

由圖2可以看出，超聲功率、酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量4 個(gè)因素中任何兩個(gè)交互因素對(duì)出汁率和透光率的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)。通過Design-Expert V8.0軟件分析得到黑莓果漿的最佳超聲輔助酶解條件為超聲功率200 W、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度45 ℃、加酶量0.3%，在此優(yōu)化條件下所得出汁率預(yù)測值為（81.58±0.47）%，透光率為（69.02±0.26）%。為驗(yàn)證模型預(yù)測值的準(zhǔn)確性，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得出汁率平均值為（80.89±0.65）%，透光率為（68.21±0.78）%，接近于模型預(yù)測值，說明本試驗(yàn)優(yōu)化模型結(jié)果可靠。

圖2 交互作用對(duì)黑莓果汁出汁率和透光率的影響Fig. 2 Response surface plots for the interactive effects of variables on blackberry juice yield and transmittance

2.3 黑莓果汁品質(zhì)比較分析

表5 不同處理?xiàng)l件下黑莓果汁品質(zhì)比較Table 5 Comparison of blackberry juice quality with different treatments

從表5可以看出，單一果膠酶或果漿酶處理的黑莓果汁出汁率、透光率顯著小于超聲酶解和復(fù)合酶解處理所得到的結(jié)果，說明超聲處理和復(fù)合酶處理有助于提高底物轉(zhuǎn)化率，促使黑莓果汁從大量果膠、纖維中溶出，并有助于提高出汁率和透光率。從表5還可以看出，超聲輔助酶解處理后的果汁總酚含量明顯高于其他處理組（P＜0.05），可見，超聲波能夠促進(jìn)酚類物質(zhì)的溶出。此外，比較4 組花色苷含量可以看出，超聲輔助酶解組結(jié)果明顯高于其他3 組，說明低功率、低溫、短時(shí)間的超聲處理并不會(huì)影響黑莓花色苷的降解，反而有助于花色苷的溶出。與已有報(bào)道相比[7-8]，超聲波輔助復(fù)合酶解不僅縮短反應(yīng)時(shí)間，提高果汁的出汁率，而且有助于營養(yǎng)成分的保持。

從圖3a～c可以看出，L*、a*、b*值隨貯藏時(shí)間發(fā)生變化。其中，L*值隨時(shí)間延長逐漸增大，a*值和b*值隨時(shí)間延長緩慢變小，這說明果汁中色素含量逐漸降低，即主要呈色物質(zhì)花色苷發(fā)生部分降解?？傮w來看，超聲輔助酶解處理的果汁樣品相較于其他4 組處理樣品的L*、a*、b*值變化較小，說明此果汁樣品透光性較低，顏色呈紅色，貯藏穩(wěn)定性較好。這可能由于超聲輔助酶解處理提高黑莓果汁中花色苷和其他多酚類物質(zhì)的溶出量，而酚類物質(zhì)能夠與花色苷發(fā)生分子間輔色作用，提高花色苷的穩(wěn)定性，最終使得果汁色澤穩(wěn)定[21-24]。

從圖3d、e可以看出，不同處理?xiàng)l件下的黑莓清汁花色苷和總酚在貯藏過程中含量呈降低趨勢，說明花色苷可能發(fā)生降解。通過擬合曲線得出各處理?xiàng)l件下方程的斜率（表6）不同，即降解速率存在差異。其中超聲輔助酶解組擬合方程的斜率絕對(duì)值小于其他組，可見超聲輔助酶解后的黑莓清汁花色苷降解速率小于其他處理組，而花色苷降解的同時(shí)，其總酚含量也隨之減少，這進(jìn)一步驗(yàn)證色度變化的結(jié)果和結(jié)論。

從圖3f可以看出，黑莓清汁在貯藏過程中的透光率呈緩慢下降趨勢，其中超聲輔助酶解處理組較其他處理組降低慢（斜率絕對(duì)值最?。?。隨著時(shí)間的延長，黑莓清汁中存在未被酶解的果膠、纖維素以及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)易與花色苷、酚類發(fā)生聚合而降低果汁透光率[25-27]。而超聲輔助酶解會(huì)提高果膠、纖維素等物質(zhì)的水解效率，減少清汁中大分子含量，降低其聚合速率，同時(shí)，酚類與花色苷分子間的輔色作用提高了花色苷的穩(wěn)定性，使得透光率降低變緩，黑莓清汁呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。

圖3 黑莓果汁色度的L*（a）、a*（b）和b*（c）、花色苷含量（d）、總酚含量（e）和透光率（f）隨貯藏時(shí)間的變化Fig. 3 Changes in color parameters L* (a), a* (b) and b* (c),anthocyanin content (d), total phenol content (e) and transmittance (f) in blackberry juice with storage time

表6 花色苷含量、總酚含量和透光率隨貯藏時(shí)間的變化曲線擬合方程斜率Table 6 Slopes of the fi tting equations of anthocyanin content, total phenol content and transmittance as a function of storage time

2.4 超聲輔助酶解黑莓漿原料的掃描電子顯微鏡分析

從圖4a、b可以看出，與未處理原料（圖4d）相比，經(jīng)超聲和酶解處理后的黑莓原料結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由于組織細(xì)胞中的內(nèi)容物質(zhì)溶出，原料呈較大多孔狀，并且超聲輔助酶解處理（圖4b）后的原料結(jié)構(gòu)上坍塌，呈現(xiàn)出較大程度的破壞。這是由于在超聲過程中，液體中壓力發(fā)生變化，超聲波能產(chǎn)生空化效應(yīng)，加速熱量和能量在介質(zhì)中的傳遞速率，而這個(gè)過程中由空泡輻射出的沖擊波足以使黑莓組織細(xì)胞發(fā)生破壁效應(yīng)[28-29]。此外，低頻率的超聲波能夠強(qiáng)化酶的活性[30-31]。本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的反應(yīng)條件（超聲功率200 W、酶解溫度45 ℃）可有效促進(jìn)體系中果膠酶和果漿酶的激活，加之超聲波對(duì)此介質(zhì)傳質(zhì)過程的影響，能夠增強(qiáng)酶與底物的接觸效率，提高底物轉(zhuǎn)化率，即提高果汁的出汁率和透光率。

圖4 不同條件處理的黑莓漿原料掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of blueberries with different treatments

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法研究超聲波協(xié)同復(fù)合酶（果膠酶+果漿酶）制備黑莓清汁的優(yōu)化工藝條件，結(jié)果表明，最佳工藝條件為超聲功率200 W、加酶量0.3%、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度45 ℃，此優(yōu)化條件下制備的黑莓清汁出汁率為80.89%，透光率為68.21%。對(duì)黑莓清汁的營養(yǎng)成分和貯藏穩(wěn)定性分析得出，花色苷含量和總酚含量明顯高于單一酶解組，且果汁色澤呈紅色，具有較好的貯藏穩(wěn)定性。進(jìn)一步對(duì)超聲波輔助酶解提高黑莓果汁品質(zhì)的機(jī)理進(jìn)行分析得出，在反應(yīng)介質(zhì)中，超聲波與酶會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，通過空化作用，引起黑莓組織細(xì)胞壁的坍塌，加速花色苷和酚類物質(zhì)的溶出，并且激活酶的催化作用，提高底物轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而提升黑莓清汁的品質(zhì)。因此，超聲輔助酶解制備黑莓清汁是一種高效手段。