黃麗 孟繼坤 周嫄 李樹波 徐羽

摘要：使用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、運(yùn)用透明圈法從甘蔗土壤中篩得高產(chǎn)右旋糖苷酶的微生物SGC-2，根據(jù)菌株的形態(tài)和16S rDNA基因序列對其進(jìn)行分析鑒定，并對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，SGC-2為巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium），該菌株的適宜產(chǎn)酶條件為：右旋糖酐T2000質(zhì)量濃度20 g/L，牛肉膏質(zhì)量濃度10 g/L，NaCl質(zhì)量濃度4 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.4 g/L，接種時間36 h，接種量3%，發(fā)酵時間96 h.該條件下，右旋糖苷酶酶活可高達(dá)28.32 U/mL，比優(yōu)化前提高了151%.該右旋糖苷酶產(chǎn)生菌為首次報道，這為篩選高產(chǎn)右旋糖苷酶微生物的研究提供了一定的理論基礎(chǔ).

中圖分類號：TS241文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.002

文章編號：2096-1553（2019）01-0011-10

關(guān)鍵詞：右旋糖酐;右旋糖苷酶;巨大芽孢桿菌;發(fā)酵優(yōu)化

0 引言

作為一種誘導(dǎo)酶，右旋糖苷酶可專一性水解右旋糖酐分子中的α-1，6 葡萄糖苷鍵，降解得到小分子的右旋糖酐、葡萄糖、異麥芽糖以及少量低聚糖等[1].右旋糖苷酶具有重要的應(yīng)用價值.如在制糖工業(yè)中，右旋糖苷酶可以降解以右旋糖酐為主的多糖聚合物，從而降低產(chǎn)品黏度，減少蔗糖損耗，提高生產(chǎn)效率[2].在口腔疾病治療方面，細(xì)菌多糖即右旋糖酐是牙菌斑的主要成分，右旋糖苷酶能夠降低黏性多糖對牙齒表面的粘附性，從而對齲齒和牙周病的防治具有重要意義[3].在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，右旋糖苷酶可以用于處理大分子右旋糖酐以制作代血漿，治療失血性休克[4].

右旋糖苷酶在動物、植物和微生物中都普遍存在，真菌和細(xì)菌等微生物是其來源.其中，真菌是商品化右旋糖苷酶的主要來源，如淡紫擬青霉（Penicillium lilacinu）、繩狀青霉（Penicillium funiculosum）、細(xì)麗毛殼菌（Chaetomium gracile）、淡黃青霉（Penicillium luteum）等[5-8].目前國內(nèi)外報道可以生產(chǎn)右旋糖苷酶的細(xì)菌包括鏈球菌屬（Streptococcus s）、黃桿菌（Flavobacterium sp）、嗜纖維菌（Cytophaga SP）、交替單胞菌（Altermonasespejiana）、交替假單胞菌（Pseudoalteromonas tetraodon）和氧化節(jié)桿菌（Arthrobacteroxydans）等[9-11].與真菌來源相比，細(xì)菌來源的右旋糖苷酶具有發(fā)酵時間較短、次生代謝產(chǎn)物少、分離純化簡便等優(yōu)勢，但其酶活力普遍較低.吳定濤等[12]從土壤篩選出一株棘孢青霉菌株，其產(chǎn)右旋糖苷酶的酶活力為75.6 U/mL.Mohamed等[13]報道的一株青霉-258產(chǎn)右旋糖酐酶的酶活力為41.8 U/mL.焦豫良等[11]從海泥篩選出的埃氏交替單胞菌A. espejiana YSN412，其右旋糖苷酶的酶活力僅為 9 U/mL.李衛(wèi)娟等[14]發(fā)現(xiàn)的海洋細(xì)菌Arthrobacter oxydans KQ11在優(yōu)化條件下產(chǎn)右旋糖苷酶的酶活力僅為4.697 U/mL.但以上研究仍存在發(fā)酵時間長或酶活性低等問題.鑒于此，本研究旨在篩選出一株細(xì)菌來源的高產(chǎn)右旋糖苷酶的菌株，對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，為篩選高產(chǎn)右旋糖苷酶微生物的研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品

廣西某糖廠甘蔗渣;某糖廠污水;甘蔗土樣.

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：右旋糖酐T2000，質(zhì)量濃度10.0 g/L;蛋白胨，質(zhì)量濃度5.0 g/L;氯化鈉，質(zhì)量濃度4.0 g/L;硫酸鎂，質(zhì)量濃度0.4 g/L;瓊脂粉，質(zhì)量濃度20.0 g/L;蒸餾水配制，pH值自然.

種子培養(yǎng)基：右旋糖酐T2000，質(zhì)量濃度6.0 g/L;蛋白胨，質(zhì)量濃度3.0 g/L;NaCl，質(zhì)量濃度2.4 g/L;MgSO4，質(zhì)量濃度0.24 g/L;蒸餾水配制，pH值自然.

液體發(fā)酵培養(yǎng)基： 右旋糖酐T2000，質(zhì)量濃度10.0 g/L;蛋白胨，質(zhì)量濃度5.0 g/L;NaCl，質(zhì)量濃度4.0 g/L;MgSO4，質(zhì)量濃度0.4 g/L;蒸餾水配制，pH值自然.

LB培養(yǎng)基：蛋白胨，質(zhì)量濃度10 g/L;酵母膏，質(zhì)量濃度5 g/L;NaCl，質(zhì)量濃度10 g/L;蒸餾水配制， pH值自然.

以上培養(yǎng)基[15]均在115 ℃ 下濕熱滅菌 30 min.

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選方法 首先，用無菌水對樣品進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋度，涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，于37 ℃溫度下倒置培養(yǎng)3～6 d.方法1：用Simonson的快速透明圈法篩選出右旋糖苷酶產(chǎn)生菌株，即將無水乙醇倒入培養(yǎng)好的平板，置于冰箱中冷凍2 h后取出，凡在菌落周圍出現(xiàn)透明圈的便是右旋糖苷酶產(chǎn)生菌.方法2：在長出菌落的平皿中倒入適量的革蘭氏碘液，可快速觀察到透明圈出現(xiàn)情況.

接著，挑取有透明圈的菌落進(jìn)行劃線純化，于37 ℃下培養(yǎng)48 h后，獲得單菌落并對其進(jìn)行編號、保藏.將保藏菌株接入種子發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃下，200 r/min 培養(yǎng)24 h.按3%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃下，200 r/min 培養(yǎng)96 h，10 000 r/min離心10 min取上清液測定酶活力大小.每個菌落設(shè)置3個平行試驗，取平均值.篩選出酶活力高的菌株進(jìn)行后續(xù)實驗[16， 17].

1.3.2 菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗方法 用固體篩選培養(yǎng)基對高產(chǎn)右旋糖苷酶菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔24 h傳代1次，于37 ℃下培養(yǎng)48 h.挑取菌株至種子培養(yǎng)基，于37 ℃下，200 r/min培養(yǎng)24 h;隨后，按3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃下，200 r/min 培養(yǎng)96 h，10 000 r/min離心10 min取上清液測定酶活力大小.菌株發(fā)酵時設(shè)置3個平行試驗，取平均值.依次傳10代，在傳代培養(yǎng)過程中，將測定OD600下菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量，并觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)及其菌落形態(tài).

1.3.3 菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：在平板上劃線接種產(chǎn)酶菌株，置于37 ℃下培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色等特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的個體形態(tài)，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[20]鑒定菌株的種屬.

分子生物學(xué)鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，使用特異性引物擴(kuò)增16S rDNA序列，擴(kuò)增上游引物27F：5＼|AGAGTTTGATCCTGGCTAG＼|3，下游引物1429R;5＼|GGTTACCTTGTTACGACTT＼|3.

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：正向引物與反向引物各1 μL，DNA模板8 μL， Prime STAR聚合酶10 μL，總計20 μL.

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃下變性10 min，98 ℃下變性0.5 min，55 ℃下退火0.5 min，72 ℃下延伸0.75 min，30 個循環(huán)，72 ℃下終延伸10 min，4 ℃下保存.

使用瓊脂糖凝膠電泳分離純化DNA，進(jìn)行膠回收目的片段，將 PCR產(chǎn)物送至上海生物工程公司測序.將所得16S rDNA基因序列于GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行Blast分析，從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件程序的NJ比鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類學(xué)地位[15， 19].

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 將篩選獲得的菌株SGC-2進(jìn)行產(chǎn)酶條件（如碳源、氮源、金屬離子等）的優(yōu)化.先測定菌株的生長曲線和發(fā)酵曲線，再優(yōu)化其他產(chǎn)酶條件.碳源為蔗糖，右旋糖酐T2000，右旋糖酐T70，α-乳糖，葡萄糖，可溶性淀粉;碳源質(zhì)量濃度分別為5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L;氮源種類分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、尿素、氯化銨、硫酸銨（10.0 g/L）;氮源質(zhì)量濃度分別為5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L，35 g/L;NaCl質(zhì)量濃度分別為0 g/L，4 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L;接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%;培養(yǎng)基裝液量分別為30 mL，40 mL，50 mL，60 mL，70 mL，80 mL.以上均設(shè)置3個平行試驗，取平均值.通過測定不同條件下酶活的變化情況，獲得碳源種類、碳源濃度、氮源種類、氮源濃度、NaCl濃度、接種時間、接種量、裝液量等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶活力的影響.

1.3.5 酶活力的測定方法 右旋糖苷酶活力測定采用DNS比色法.具體操作如下：發(fā)酵液置于10 000 r/min離心10 min后，取上清液得粗酶液.取適當(dāng)稀釋后的粗酶液0.5 mL，加入到含有1.5 mL 3%右旋糖酐T70（緩沖液）的具塞刻度試管中，于45 ℃下水浴保溫15 min，立即按DNS 法測定還原糖含量[18].

參照葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的還原糖含量，最終計算出酶活力.酶活力單位（U/mL）定義：在上述反應(yīng)條件下，每mL酶液在1 min內(nèi)使底物降解生成 1 μmol葡萄糖所需的酶量.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)右旋糖苷酶微生物的篩選結(jié)果

2.1.1 初篩結(jié)果 各采樣點(diǎn)樣品稀釋涂布劃線培養(yǎng)篩選出產(chǎn)酶菌株情況如表1所示，產(chǎn)酶菌株初篩平板透明圈結(jié)果如圖1所示.

由表1可知，使用酒精透明圈法可以篩選出產(chǎn)右旋糖酐酶產(chǎn)生菌，但將產(chǎn)透明圈菌株劃線至篩選培養(yǎng)基時，菌株存活率相對低.其原因可能是由于酒精存貯時間太久而具有毒害作用和冷凍對菌種的影響，導(dǎo)致菌株劃線培養(yǎng)時基本都不生長.而使用碘液法則可避免這種問題，即將革蘭氏碘液倒入長出菌落的平板中，過30 s后培養(yǎng)基會染成深棕色，而右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的周圍便會有透明圈.這種方法不僅快速、便捷，且劃線生長率也比酒精透明圈法高.

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 用透明圈法對全部菌株進(jìn)行初篩和純化培養(yǎng)，共獲得存活的產(chǎn)透明圈菌株50株.將其接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃下，200 r/min培養(yǎng)6 d后，10 000 r/min離心取得上清液，測定酶活力，其中酶活力較高的菌株發(fā)酵復(fù)篩的結(jié)果見表2 .從表2復(fù)篩的結(jié)果可以看出，菌株SGC-2的酶活力最高為11.26 U/mL.

2.2 菌株的發(fā)酵遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

傳代培養(yǎng)過程中菌株的生物量及酶活變化如圖2所示.由圖2可知，從第1代至第10代菌液的生物量變化不大，菌株在平板上的菌落形態(tài)相同，在光學(xué)顯微鏡下觀察傳代過程中菌株細(xì)胞形態(tài)，其形態(tài)特征一致，無明顯突變現(xiàn)象.經(jīng)傳代發(fā)酵培養(yǎng)，第1代至第10代的酶活相對穩(wěn)定，均在11.2 U/mL左右，無明顯下降現(xiàn)象.這說明菌株SGC-2具有穩(wěn)定的遺傳特性，可以選擇其作為后續(xù)研究的試驗菌株.

2.3 菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 菌株SGC-2在篩選培養(yǎng)基上生長24 h后形成的菌落形態(tài)特征如圖3所示.由圖3a）可知，菌體呈圓形，黃褐色，邊緣整齊，表面光滑，濕潤.由圖3b）可知，在顯微鏡下，菌體呈桿狀，末端圓，大小約1.4 μm×3.5 μm，單個或呈短鏈排列，可運(yùn)動.

2.3.2 分子學(xué)鑒定 利用16S rDNA 通用引物對菌株SGC-2基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，凝膠電泳圖如圖4所示.由圖4可知，在1500 bp處有一明亮的特征條帶，瓊脂糖凝膠膠回收純化目標(biāo)條帶后，經(jīng)上海生工生物有限公司測序，將所得16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行Blast分析，從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，經(jīng)NCBI序列比對，菌株SGC-2與Bacillus megaterium strain（NR112636.1）巨大芽孢桿菌序列匹配度為100%.利用MEGA7.0軟件和Cluster W軟件，運(yùn)用NJ比鄰法對包括待鑒定菌株SGC-2在內(nèi)的12株近緣模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖5所示.圖5顯示：菌株SGC-2與巨大芽孢桿菌進(jìn)化親緣關(guān)系高達(dá)90%，由此可鑒定SGC-2為巨大芽孢桿菌屬.

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗結(jié)果

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上，對接種時間、培養(yǎng)基碳源和氮源、NaCl質(zhì)量濃度、菌株接種量、培養(yǎng)基裝液量進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方.

2.4.1 接種時間與產(chǎn)酶發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響

接種時間是影響菌株SGC-2生長的重要因素.

將菌株SGC-2接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃ 下200 r/min振蕩培養(yǎng)134 h，其間定時取發(fā)酵液，利用比濁法測定OD600值，繪制生長曲線見圖6.

圖6顯示，在初始36 h內(nèi)，菌株生長變化不明顯，菌體增殖緩慢，生物量緩慢提升;當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到48 h以后，菌株進(jìn)入對數(shù)期，菌體快速增殖，生物量急劇提高;96 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體總量達(dá)到峰值，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間至108 h以后，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗已經(jīng)不利于菌體生長代謝物的積累，導(dǎo)致菌體自溶，菌體生物量呈下降趨勢.故菌株的最佳接種時間為36 h.

定時間隔取發(fā)酵液，置于10 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液測定酶活，其結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，初始培養(yǎng)48 h內(nèi)，菌株產(chǎn)右旋糖苷酶酶活較低，表明培養(yǎng)初期菌株主要靠消耗營養(yǎng)物質(zhì)來維持菌體的增殖，基本不代謝產(chǎn)酶.當(dāng)發(fā)酵時間超過48 h后，右旋糖苷酶活大幅度提高，至96 h產(chǎn)酶達(dá)到峰值，酶活為10.24 U/mL.這表明當(dāng)菌株增殖到一定程度時，菌株開始分泌右旋糖苷酶，酶活出現(xiàn)劇增.隨發(fā)酵過程的繼續(xù)進(jìn)行，96 h后產(chǎn)酶量開始降低，其原因是此時菌株進(jìn)入衰亡期及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致菌體的產(chǎn)酶能力減弱.所以，菌株的生物量與產(chǎn)酶能力有較密切的關(guān)系，為保證發(fā)酵過程中充分利用菌體增殖提高產(chǎn)酶能力，產(chǎn)酶發(fā)酵周期不宜超過96 h.

2.4.2 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 右旋糖苷酶屬于誘導(dǎo)酶，不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶均有影響（見圖7）.分別以質(zhì)量濃度為10 g/L的蔗糖，右旋糖苷T2000，右旋糖苷T70，α-乳糖，葡萄糖，可溶性淀粉作為碳源，于37 ℃下，200 r/min發(fā)酵134 h，測定酶活力，結(jié)果如圖7a）所示.從圖7a）可知，在6種碳源中，以右旋糖酐T2000發(fā)作為碳源時右旋糖苷酶活力最高，可達(dá)到

12.29 U/mL;其次為右旋糖酐T70，以蔗糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源時的產(chǎn)酶能力相對較弱，在5 U/mL左右;以葡萄糖為底物時幾乎不產(chǎn)右旋糖苷酶.因此選擇右旋糖酐T2000為發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)碳源.

在確定最適碳源后，考察碳源質(zhì)量濃度對右旋糖苷酶酶活的影響，結(jié)果如圖7b）所示.由圖7b）可知，隨著右旋糖苷T2000添加量的增加，右旋糖苷酶活呈先上升后逐漸下降的趨勢，當(dāng)右旋糖苷T2000質(zhì)量濃度為20 g/L時，酶活達(dá)到14.6 U/mL，當(dāng)其質(zhì)量濃度超過20 g/L后，右旋糖苷酶活力逐漸降低.故20 g/L為右旋糖酐T2000最適質(zhì)量濃度.

2.4.3 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

不同氮源種類和質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶有重要影響（見圖8）.

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以質(zhì)量濃度為20 g/L的右旋糖酐T2000為培養(yǎng)基的碳源，分別添加質(zhì)量濃度為20 g/L 的牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、尿素、氯化銨、硫酸銨進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，試驗結(jié)果如圖 8a）所示.由圖8a）可知，菌株SGC-2在以牛肉膏、蛋白胨等有機(jī)氮源作為氮源時右旋糖苷酶活力較高，其中以牛肉膏為氮源時酶活最高，達(dá)到19.86 U/mL.無機(jī)氮源的產(chǎn)酶能力相對低，其原因可能為蛋白胨和牛肉膏成分復(fù)雜，營養(yǎng)豐富，不僅可以作為氮源，還可以提供生長因子，促進(jìn)微生物生長，從而提高產(chǎn)酶能力.因此，選擇牛肉膏作為最佳氮源.

以牛肉膏為氮源，考察氮源質(zhì)量濃度5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L和30 g/L對右旋糖苷酶酶活的影響，其結(jié)果如圖8b）所示.隨牛肉膏質(zhì)量濃度的不斷增加，右旋糖苷酶活力呈先提高后下降的趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度為10 g/L時，右旋糖苷酶活最高，達(dá)到22.45 U/mL.因此，確定牛肉膏的最適質(zhì)量濃度為10 g/L.

2.4.4 NaCl 質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響 為了研究氯化鈉濃度對菌株產(chǎn)酶的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈉至不同質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖9所示.菌株的最適產(chǎn)酶NaCl質(zhì)量濃度為4 g/L，當(dāng)NaCl 質(zhì)量濃度高于15 g/L后，菌株的產(chǎn)酶能力明顯下降.當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到25 g/L時，右旋糖苷酶產(chǎn)量不足最大產(chǎn)酶量的50%.由此可見，菌株產(chǎn)酶對NaCl質(zhì)量濃度較為敏感.

2.4.5 接種量對產(chǎn)酶的影響 不同接種量對右旋糖苷酶酶活的影響如圖10所示.由圖10可知，接種量過低會造成發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)過剩，微生物生長量不能產(chǎn)生足量的右旋糖苷酶，導(dǎo)致酶活偏低;接種量過高，菌體繁殖太多，發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)不足以維持產(chǎn)酶，會導(dǎo)致酶活下降，故考察接種量對右旋糖苷酶酶活力的影響.在裝液50 mL的發(fā)酵瓶中，當(dāng)接種量由1%升至3%時，菌株產(chǎn)右旋糖苷酶酶活明顯提高;當(dāng)接種量為3%時，達(dá)最高酶活，為23.32 U/mL;當(dāng)接種量超過3%時，酶活逐漸下降.故選擇3%為最佳接種量.

2.4.6 裝液量對產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵液中溶氧量和氧氣的傳遞效率與搖瓶裝液量直接相關(guān)，會影響發(fā)酵液中菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用速率，從而影響右旋糖苷酶的生產(chǎn)效率.巨大芽孢桿菌為需氧微生物，所以裝液量的大小直接影響著它的生長和右旋糖苷酶的產(chǎn)生.不同裝液量對右旋糖苷酶酶活的影響如圖11所示.由圖11可知，在250 mL錐形瓶中加入30～80 mL 的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，菌株產(chǎn)右旋糖苷酶的酶活隨著裝液量的增加先提高后降低：當(dāng)裝液量達(dá)到50 mL時，酶活達(dá)到最高，為24.48 U/mL;之后隨裝液量的逐步提高，產(chǎn)酶活逐漸降低.裝瓶量過少，水分容易揮發(fā)，不能給菌株提供正常生產(chǎn)的足量營養(yǎng)，導(dǎo)致酶活偏低.而裝液量過高時，氧氣不足會影響菌株正常的新陳代謝.因此，確定右旋糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的最適裝液量為50 mL.

2.4.7 綜合試驗優(yōu)化結(jié)果 在上述優(yōu)化的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，分別發(fā)酵培養(yǎng)菌株84 h，96 h，108 h，進(jìn)一步確定產(chǎn)酶條件優(yōu)化的可靠性.其結(jié)果如表3所示，在84 h，96 h，108 h這3個時間點(diǎn)，右旋糖苷酶酶活先升高后降低，其變化趨勢同菌株的生長、發(fā)酵曲線一致.當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)96 h時，酶活達(dá)到最高，為28.32 U/mL，比優(yōu)化前的11.26 U/mL提高了151%.

3 結(jié)論

本文用透明圈法從甘蔗土壤中篩選出了一株新的產(chǎn)高活性右旋糖苷酶菌株，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌，對該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到該菌株產(chǎn)右旋糖苷酶發(fā)酵最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：右旋糖酐T2000質(zhì)量濃度20 g/L，牛肉膏質(zhì)量濃度10 g/L，NaCl質(zhì)量濃度4 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.4 g/L，接種時間36 h，接種量3%，發(fā)酵時間96 h.該條件下酶活達(dá)到28.32 U/mL，與優(yōu)化前的酶活11.26 U/mL 相比，提高了151%.該右旋糖酐酶產(chǎn)生菌目前未見相關(guān)報道，而且其產(chǎn)酶量較高，比其他產(chǎn)右旋糖酐酶產(chǎn)生細(xì)菌具有更大優(yōu)勢.本研究發(fā)現(xiàn)了新來源的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌，為篩選高產(chǎn)右旋糖苷酶微生物的研究提供了一定的理論基礎(chǔ).

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