許春平 曲利利 姜宇 馬宇平 孫斯文 王宣靜

摘要：為降低再造煙葉中的果膠含量，采用單因素試驗和正交試驗對微紫青霉產果膠酶降解果膠的工藝條件進行優(yōu)化，分析了酶解前后樣品的熱裂解產物，并將酶解后樣品抄造制絲添加至卷煙中進行感官評價，結果表明：微紫青霉產果膠酶降解果膠的最佳反應條件為酶活力3000 U/mL，高濃混合漿干重與粗酶液體積的料液比1GA6FA1，反應溫度50 ℃，處理時間3 h.在此條件下果膠降解率達到最大，為28.63%，相對分子量由341 kDa減小到55 kDa.酶解后樣品裂解產物的組成和含量發(fā)生明顯變化，除醇類物質外，其他香味物質酚類、醛酮類、酯類、雜環(huán)類減少.將酶解后的樣品抄造制絲添加于卷煙中，香氣質豐滿細膩，透發(fā)性、甜潤感增強，刺激性減小，余味純凈舒適，吸食品質得以改善，但勁頭略有不足.

關鍵詞：微紫青霉;果膠酶;再造煙葉;果膠降解率

中圖分類號：TS41文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004

文章編號：2096-1553（2019）01-0027-09

0 引言

果膠是構成煙草細胞壁的主要物質之一，在煙草中的含量約占5%～13%（若無特指，百分數(shù)均為質量分數(shù)），它是以半乳糖醛酸為主鏈，并連接著2-吡喃型鼠李糖基的復合多糖類物質[1-3].這類物質在熱解時會產生甲醇，并進一步氧化為甲醛、甲酸等，這些氧化產物會增加煙草燃吸時的刺激性，對煙草的內在品質和安全性產生不利影響[4-6]，對人體有害.因此，適當降低煙葉中果膠的含量，對于提升煙葉品質、降低卷煙危害，具有重要的意義.

煙草果膠降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通過對煙梗絲施加復合酶，使煙梗絲中的果膠含量降低13.08%.于建軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對煙葉施加果膠酶后會使煙草香氣物質含量增加29.94%，可能是由于施加果膠酶后使煙葉中總糖含量增加所致.于興偉等[9]采用固態(tài)發(fā)酵法用黑曲霉處理煙梗，發(fā)現(xiàn)煙草中果膠含量也明顯降低.馬東萍等[10]選用復合中性纖維素酶、酸性蛋白酶、復合果膠酶和中性脂肪酶配制成一種改性添加劑，這種改性添加劑可對煙梗中果膠、蛋白質等大分子化合物進行有效的生物降解和轉化，從而改善萃取液中的致香物質.柏婷[11]利用生物酶解技術和化學技術對果膠進行降解.結果表明，當果膠酶質量分數(shù)為0.5%時，煙草中果膠含量由18.61%降低至 9.52%，且再造煙葉煙香較濃，刺激性明顯下降，感官品質也得到明顯改善.然而，利用微紫青霉生產果膠酶并將其應用于煙草果膠降解的報道則相對較少[12-14].鑒于此，本研究擬采用從煙田土壤中分離出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09菌株，根據(jù)該菌株高產果膠酶的特性，利用其粗酶液對造紙法再造煙葉混合漿料進行果膠降解處理，并進一步開展化學分析和感官質量評價，以期為煙葉品質提升和卷煙危害成分降低研究提供參考和借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料：配方煙絲，河南中煙工業(yè)有限責任公司提供;高濃混合漿，取自河南煙草工業(yè)薄片有限公司工藝生產線;果膠酶為由鄭州輕工業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室篩選的微紫青霉sw09產出的粗果膠酶液，即發(fā)酵上清液.

試劑：3，5-二硝基水楊酸（DNS），天津市光復精細化工研究所產;果膠標準品（酯化度67%～70%），Sigma＼|Aldrich公司產;D-（+）-半乳糖醛酸一水化合物標準品（純度97%）和0.15%的咔唑溶液，天津市光復精細化工研究所產.

儀器：ATY124型電子分析天平，日本島津公司產;Ultra3400型紫外分光光度計，北京普源精電科技有限公司產;HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產;Agilent6890/5973型氣質聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司產;CDSPYROPROBE2000裂解儀，上海光譜儀器有限公司產.

1.2 實驗方法

1.2.1 微紫青霉產果膠酶粗酶液的獲取

將活化后的微紫青霉sw09接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（質量濃度分別為葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO4 1 g/L，果膠2 g/L，pH=5）[15].發(fā)酵條件為：5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌速度150 r/min，通氣量2 V/（V·min），發(fā)酵溫度32 ℃，初始pH=5，發(fā)酵時間72 h.待發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液離心取上清液，即為果膠酶粗酶液[16].

1.2.2 微紫青霉產果膠酶粗酶液降解混合漿中果膠單因素試驗

酶活的定義為：在45 ℃，pH=5條件下，1.0 mL酶液每min分解果膠產生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸，即為一個酶活單位（1 U/mL）.通過單因素試驗研究不同酶活力、酶解時間和反應溫度條件下，微紫青霉產果膠酶粗酶液對混合漿中果膠含量的降解情況.

1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果膠能力的試驗[17]

將不同酶活力的粗酶液（14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL，1000 U/mL，700 U/mL 和450 U/mL），以料液比（m（混合漿干重/g）GA6FAV（粗酶液體積/mL），下同）為1GA6FA3的比例均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測定各處理組樣品果膠含量，每組試驗重復3次.

1.2.2.2 不同酶解時間下粗酶液降解果膠能力的試驗

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下分別酶解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h.待酶解結束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測定各處理組樣品果膠含量，每組試驗重復3次.

1.2.2.3 不同料液比降解果膠能力的試驗

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以不同料液比（1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5，1GA6FA7和1GA6FA9）均勻噴施于10 g混合漿上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測定各處理組樣品果膠含量，每組試驗重復3次.

1.2.2.4 不同反應溫度下粗酶液降解果膠能力的試驗

將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均勻噴施于10 g混合漿上，分別在30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃和55 ℃條件下酶解2.0 h.待酶解結束后，置于70 ℃烘箱中使酶滅活，測定各處理組樣品果膠含量，每組試驗重復3次.

1.2.3 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果設計正交試驗，以果膠降解率為優(yōu)化目標，對酶活力、酶解時間、料液比、反應溫度等果膠降解條件進行優(yōu)化.

1.3 測定方法

1.3.1 果膠含量測定方法

分別稱取5 g（精確至0.001 g）經果膠酶處理前后的樣品進行粉碎，過250目篩.然后參考劉玉佳等[18]的方法對樣品中的果膠含量進行定量分析.

根據(jù)咔唑比色法測定果膠含量，以D-（+1）-半乳糖醛酸一水化合物為標準品.首先移取1 mL待測液于裝有6 mL濃H2SO4的試管，搖勻.在85 ℃水浴條件下加熱15 min.待試管冷卻后，加入0.3 mL 0.15%的咔唑無水乙醇溶液，搖勻，暗置30 min后在 530 nm下測吸光度值.根據(jù)咔唑比色法標準曲線和下列公式，計算待測液中果膠含量[19].

果膠含量=C×V×K×100/（W×106）

式中，C為對照標準曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量/（μg·m-1），V為果膠提取液原液體積/ mL，K為果膠提取液稀釋倍數(shù)，W為樣品質量/g，106為質量單位換算系數(shù).

實驗組和對照組果膠含量的測定按照上述方法進行，果膠降解率的計算公式如下：

Ei=（C0-Ci）/C0×100%

式中，Ei為果膠的降解率/%，C0為空白對照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質量濃度/（mg·mL-1），Ci為加酶處理的樣品中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質量濃度/（mg·mL-1）[13].

1.3.2 果膠相對分子量的測定

在1.3.1中總果膠提取液中加入質量濃度為0.1 g/mL的活性炭進行脫色，脫色完成后離心提取上清液進行旋蒸，待旋蒸至原體積1/5后加入1.5倍體積的無水乙醇用于沉淀果膠，靜置、離心得到果膠粗品后再復溶以Sevage法[18]除蛋白，再經醇沉、離心、冷凍干燥得到果膠粉末.

用濃度為0.2 mol/mL的NaCl緩沖液平衡Sepharose CL-6B凝膠柱，每5 min收集一管洗脫液，洗脫速度為1.5 mL/min.用2 mL質量濃度為5 mg/mL的標準葡聚糖（T-150，T-70，T-40，T-10）分別上樣，采用苯酚-硫酸法[20]在波長490 nm處跟蹤顯色，峰值處為洗脫體積Ve，標準糖的分配系數(shù)Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo），其中Vt為柱床體積/mL，Vo為外水體積/mL.以Kav為橫坐標，葡聚糖標準品分子量的對數(shù)（logM）為縱坐標繪制標準曲線.在相同條件下測定酶解前后果膠的Ve/mL，根據(jù)標準曲線計算其相對分子量.

1.3.3 熱裂解產物的測定

稱取一定量酶解前后的樣品置于裂解裝置中，對裂解產物進行重復測定.裂解條件參考郝輝等[13]的方法.試驗重復3次，結果取平均值.

1.4 感官評價

在正交試驗得到的最佳酶解條件下，對高濃混合漿進行酶解，然后抄造切絲，按煙絲重量15%的比例與配方煙絲均勻混合后上機卷制.酶解處理后的樣品作為試驗組，100 ℃煮沸滅活酶液處理后的樣品作為對照組，蒸餾水處理后的樣品作為空白組.

按照標準要求[21]，將處理前后的煙絲進行卷制，然后在（22±2）℃，（60±5）%相對濕度的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進行感官評價.

2 結果與分析

2.1 果膠酶解的單因素試驗結果

圖1為酶活力、酶解時間、料液比和反應溫度對果膠降解率的影響.由圖1可以看出，隨著酶活力的減小，樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢.當酶活力達到3000 U/mL后，進一步增加酶活力對樣品果膠的降解率無明顯影響.因此選擇酶活力為14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL的粗酶液作為正交試驗設計中酶活力的3個水平.果膠的降解率隨酶解時間的延長而增大.當酶解時間增加到2.5 h時，樣品中果膠的降解率達到最大值，接近28%.因此選擇酶解時間2.0 h，2.5 h和3.0 h作為正交試驗設計中酶解時間的3個水平.料液比對樣品中果膠的降解率的影響不大，因此選擇料液比1GA6FA1，1GA6FA3，1GA6FA5作為正交試驗設計中料液比的3個水平.隨反應溫度的升高，樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.當反應溫度為45 ℃時，果膠的降解率達到最大值，接近28%.因此選擇溫度40 ℃，45 ℃和50 ℃作為正交試驗設計中反應溫度的3個水平.

2.2 正交試驗優(yōu)化結果

根據(jù)以上單因素試驗結果，選取酶活力（A），料液比（B），酶解溫度（C），反應時間（D）4種因素設計L9（34）的正交試驗方案，試驗結果和方差分析結果分別見表1和表2.

對表1中極差R值大小進行比較可知，各個因素對降解率的影響由大到小依次為：反應時間>反應溫度>酶活力>料液比.其中酶活力以3000 U/mL為最優(yōu)，料液比以1GA6FA1為最優(yōu)，酶解溫度以50 ℃為最優(yōu)，反應時間以3.0 h為最優(yōu)，4種因素對果膠降解率的最優(yōu)組合為A3B1C3D3.在該最優(yōu)組合條件下進行驗證，果膠的降解率達到最大28.63%.楊慧芳[22]以酶活 1 467.29 U/mL的青霉JXY-17發(fā)酵粗酶液在50 ℃條件下酶解煙梗12 h，果膠質降低29.38%.與其結果相比，本研究的酶活力更高，降解效果相似，但酶解時間大大縮短，更適用于工業(yè)生產.施林燕[7]以工業(yè)復合酶酶解煙梗絲4 h，果膠降解13.08%.與其結果相比，本研究的降解效果大大提升.

從表2可以看出，反應溫度和反應時間的F值均大于F0.01（2，18）=6.01，說明反應溫度和反應時間對果膠的降解率影響極顯著;酶活力和料液比的F值均大于F0.05（2，18）=3.55，但小于F0.01（2，18）=6.01，說明酶活力和料液比對果膠的降解率影響顯著.

2.3 相對分子量的測定結果

以分配系數(shù)（Kav）為橫坐標、葡聚糖標準品分子量的對數(shù)（logM）為縱坐標作標準曲線，結果如圖2所示.其線性回歸方程為

y=-5.485 8x+6.537 9R2=0.993 7

由此計算得出的高濃混合漿中果膠相對分子量為341 kDa，經果膠酶處理后樣品中果膠的平均相對分子量明顯降低至55 kDa，說明經微紫青霉果膠酶處理后，樣品中果膠大分子得到有效降解.

2.4 樣品酶處理前后熱裂解產物分析

實驗選擇300 ℃，600 ℃和900 ℃共3個溫度對高濃混合漿酶解前后的熱裂解產物進行裂解分析.結果發(fā)現(xiàn)，在裂解溫度為600 ℃時裂解物質最多，裂解效果最好，因此本實驗僅列出熱裂解溫度為600 ℃的結果.根據(jù)官能團不同，將檢測出的化合物分為7類，分析結果見表3.

從表3可以看出，與原樣品相比，混合漿經酶解后香氣組分和含量均發(fā)生了變化.其中，18種酚類物質總量由7.10%減少到0.63%，以苯酚、鄰甲酚、對甲酚的減少最為明顯，酚類物質含量的下降有助于減少雜氣的生成.果膠熱裂解生成乙酸[8]，酶解后的果膠含量降低，乙酸含量由12.71%減少到10.65%，減輕了煙氣吸味的刺激性.煙氣中酚類物質和羧酸類物質部分來自于果膠的分解，由于果膠被果膠酶酶解，導致裂解產物中酚類物質和羧酸類物質下降[23].酶解后含氮雜環(huán)類物質總含量降低，由5.98%降至4.28%，其中煙堿由2.2%降低至1.88%，減少了有毒物質的生成.酶解后醇類物質總量由2.51%增加到2.83%.酶解后樣品中醛酮類含量由16.27%減少到15.45%，由于煙草熱裂解過程中產生的大部分揮發(fā)性羰基類物質是在纖維素、半纖維素、木質素和果膠等裂解之后的燃燒過程中形成的，因此果膠被降解，會導致煙草熱裂解后揮發(fā)性羰基類物質含量下降[24]，醛酮類物質含量下降有可能會影響卷煙的風格特性，但是可以通過加香加料或者增加配方煙絲的用量進行彌補.

2.5 感官評價結果

感官評吸結果見表4.由表4可知，將經過微紫青霉產果膠酶處理的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后，卷煙香氣質豐滿細膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤感增強，刺激性減輕，也減少了煙氣中的雜氣，口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適，吸食品質得以改善，但勁頭略有不足.

3 結論

本文通過單因素試驗和正交試驗對微紫青霉產果膠酶降解高濃混合漿中果膠的工藝條件進行了優(yōu)化，對酶解前后樣品的熱裂解產物進行了分析，并將酶解后樣品添加至卷煙中進行感官評價，得到如下結論.

1）微紫青霉酶降解高濃混合漿中果膠的最優(yōu)條件為：酶活力3000 U/mL，料液比1GA6FA1，酶解溫度50 ℃，處理時間3 h，此時樣品中果膠降解率為28.63%，果膠分子量由341 kDa降低至55 kDa.

2）酶解后樣品的熱裂解產物中，除醇類外，其他香味物質醛酮類、酯類、雜環(huán)類等的含量均減少.

3）將酶解后的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后，卷煙香氣質豐滿細膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤感增強，刺激性減輕，也減少了煙氣中的雜氣，口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適，吸食品質得以改善，但勁頭略有不足.

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