胡永金 任淑娣 王知榮 柴建國 許佳威

中圖分類號：TS214.2文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.001

文章編號：2096-1553（2019）01-0001-10

關(guān)鍵詞：腐乳;毛霉;混合菌種發(fā)酵;蛋白酶活力

摘要：從腐乳毛坯中分離得到毛霉M/T，以毛霉40899和毛霉M/T為混合發(fā)酵劑，采用單因素法和響應(yīng)面法研究混合菌種發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵工藝，并在最優(yōu)前發(fā)酵條件下考察混合菌種發(fā)酵過程中腐乳的氨基酸態(tài)氮、質(zhì)構(gòu)特性和色度的變化，得出如下結(jié)果：經(jīng)鑒定，毛霉M/T為放射毛霉屬;腐乳前發(fā)酵最優(yōu)條件為發(fā)酵時間60 h，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5.在此條件下，腐乳的蛋白酶活力達到最大值48.015 U/mL.腐乳后發(fā)酵至30 d時，腐乳中氨基酸態(tài)氮含量為0.53 g/（100 g），達到腐乳行業(yè)標(biāo)準中的成熟標(biāo)準.腐乳成熟時的硬度、黏附性、彈性等質(zhì)構(gòu)特性良好，色差值與市售成熟腐乳接近.

0 引言

腐乳是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品，它以大豆為基本原料，利用多種微生物對其進行協(xié)同發(fā)酵而制成，風(fēng)味獨特，質(zhì)地鮮美，營養(yǎng)豐富[1-3]，因而受到全球消費者的喜愛.目前我國的腐乳生產(chǎn)仍以傳統(tǒng)工藝為主，由于不同的菌種在發(fā)酵過程中所分泌的酶系不同，現(xiàn)腐乳的發(fā)酵生產(chǎn)存在周期長、受季節(jié)限制、效率低、產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味穩(wěn)定性難以控制等問題.

腐乳的發(fā)酵是微生物及其所產(chǎn)生的酶系不斷作用的過程，核心工藝是蛋白酶系將蛋白質(zhì)分解成多肽、氨基酸等小分子化合物，以及風(fēng)味物質(zhì)的形成[4-8].為了縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量，篩選出高產(chǎn)且蛋白酶系齊全的發(fā)酵菌株是腐乳生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵.趙玉蓮等[9]從各地腐乳樣品中分離出一些微生物，并對產(chǎn)酶情況進行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同廠家所選用的菌種不同，產(chǎn)酶類別和含量不同，所需培養(yǎng)周期也不同.M.Frans等[10]研究了食鹽對腐乳中蛋白質(zhì)和脂肪水解的影響發(fā)現(xiàn)，低鹽條件（質(zhì)量分數(shù)8%）下腐乳成熟時間縮短至40 d.B.Z.Han等[11]利用少孢根霉發(fā)酵腐乳，顯著改善了產(chǎn)品風(fēng)味.目前我國工業(yè)生產(chǎn)多采用純菌種發(fā)酵腐乳，然而單一菌種發(fā)酵存在酶系不全，風(fēng)味單調(diào)等問題[12， 13].鑒于此，本研究擬對毛霉40899和毛霉M/T混合發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，并對后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、質(zhì)構(gòu)特性及色度進行測定，以期為品質(zhì)優(yōu)良的腐乳發(fā)酵劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

食品原料：新鮮豆腐、潤豐油腐乳、食鹽、白酒、辣椒粉、花椒粉、胡椒粉、植物油，均購自昆明沃爾瑪超市.

實驗試劑：乳酸酚棉蘭染液、福林酚，索萊寶生物科技有限公司產(chǎn);干酪素、酚酞、碳酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn);乳酸、三氯乙酸，廣東光華科技股份有限公司產(chǎn);甲醛溶液，成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（生化試劑BR），青島高科園海博生物科技有限公司產(chǎn).

菌種：毛霉40899，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;菌株M/T，分離自天和腐乳毛坯，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實驗室保存.

1.1.2 實驗設(shè)備

HWS24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn);BSC-250恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn);PHS-3CpH計，儀電科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安有限公司產(chǎn);TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，超技儀器有限公司產(chǎn);EX30光學(xué)顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn);H2-16KR臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設(shè)備有限公司產(chǎn);CR-400型色差計，日本柯尼卡美能達公司產(chǎn);SHA-BA恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司產(chǎn);熱板IT-09A5磁攪拌器，上海一恒科技有限公司產(chǎn);SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株M/T的鑒定

采用選擇性培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）從天和腐乳毛坯分離得到優(yōu)勢菌株M/T，并將該菌株點種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)2 d后進行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定.

1.2.2 發(fā)酵工藝流程

前期發(fā)酵：新鮮豆腐→切塊（3 cm×3 cm×1.5 cm）→紫外燈殺菌30 min→蘸浸菌懸液→噴灑乳酸→溫度28 ℃，濕度96%條件下發(fā)酵→毛坯.

后期發(fā)酵：毛坯→搓毛→腌坯→配料→裝瓶→灌油→后酵→成熟.

1.2.3 混合菌種發(fā)酵腐乳前發(fā)酵條件的單因素試驗

1）發(fā)酵時間對混合菌種發(fā)酵腐乳的影響試驗.

基于預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置發(fā)酵溫度28 ℃，濕度96%，菌懸液濃度1.0×107 CFU/mL，毛霉40899與菌株M/T質(zhì)量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5，測定不同時間段（24 h，36 h，48 h，60 h，72 h）混合菌種發(fā)酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

2）毛霉40899與菌株M/T質(zhì)量比對混合菌種發(fā)酵腐乳的影響試驗.

設(shè)置發(fā)酵溫度28 ℃，濕度96%，菌懸液濃度1.0×107 CFU/mL，乳酸pH值3.5，發(fā)酵時間60 h，測定毛霉40899與菌株M/T不同質(zhì)量比（1GA6FA3，1GA6FA2，1GA6FA1，2GA6FA1，3GA6FA1）的混合菌種發(fā)酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

3）乳酸pH值對混合菌種發(fā)酵腐乳的影響試驗.

設(shè)置發(fā)酵溫度28 ℃，濕度96%，菌懸液濃度1.0×107 CFU/mL，發(fā)酵時間 60 h，毛霉40899與菌株M/T質(zhì)量比1GA6FA1，測定不同乳酸pH值（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0）混合菌種發(fā)酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化混合菌種發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵條件

利用響應(yīng)曲面Box＼|Behnken試驗設(shè)計，以蛋白酶活力為反映指標(biāo)，選取發(fā)酵時間、毛霉40899與菌株M/T質(zhì)量比、乳酸pH值 3個影響顯著的因素，進行3因素3水平的試驗設(shè)計[14-15].

1.2.5 測定方法

菌懸液濃度的測定采用血球計數(shù)板法[16];蛋白酶活力測定采用福林酚法[17];氨基酸態(tài)氮含量按照腐乳行業(yè)標(biāo)準SB/T 10170—2007進行測定[18];采用質(zhì)構(gòu)儀位移模式，用兩種探頭對腐乳的質(zhì)地剖面進行質(zhì)構(gòu)特性分析與測定[19];以市售的潤豐油腐乳為對照樣，采用CR-400型色差計的L*a*b*測量系統(tǒng)對色度進行測定[20].

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel，Design Expert8.0，Origin9.0分析處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M/T的鑒定結(jié)果

通過乳酸石碳酸棉藍染色實驗，顯微鏡下菌株M/T的形態(tài)如圖1所示.

由圖1可知，菌株M/T的菌絲無橫隔，孢子囊頂生，球形，孢囊梗直立分支多集中于頂端，無假根.包囊孢子大多數(shù)呈圓形，少數(shù)呈橢圓形.此外，該菌株的最適生長溫度為28 ℃，對數(shù)生長期為6～36 h，對葡萄糖的利用率高于對果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖的利用率，對淀粉利用率最差.根據(jù)以上實驗結(jié)果可初步判斷菌株M/T為毛霉科（Mucoraceae），放射毛霉屬（Actinomucor）[21].

2.2 腐乳前發(fā)酵條件的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵時間對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響 在毛霉40899與菌株M/T質(zhì)量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5條件下，

不同發(fā)酵時間對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響如圖2所示.由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢.在發(fā)酵的第60 h，蛋白酶活力達到最大值34.371 U/mL.這是由于從發(fā)酵初期到發(fā)酵60 h這一階段，腐乳毛坯上的霉菌不斷生長代謝繁殖，霉菌菌絲也不斷生長，菌絲群的代謝率處于旺盛期，因而蛋白酶活力不斷增長;隨著發(fā)酵時間的進一步延長，腐乳毛坯表面的菌絲開始變黑變黃，出現(xiàn)孢子，霉菌菌絲開始老化.因此，選擇60 h為適宜的發(fā)酵時間.

2.2.2 毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響

在發(fā)酵時間60 h，乳酸pH值3.5條件下，毛霉40899與毛霉M/T不同質(zhì)量比對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響如圖3所示.由圖3可知，隨著毛霉40899在混合菌種中的占比不斷增加，蛋白酶活力也越來越高，在菌種配比為1GA6FA1時達到最大值，接近30 U/mL.兩者的混合可能使菌種之間取長補短，促進蛋白酶活力的增加.而當(dāng)毛霉40899在混合菌種中的占比繼續(xù)增大時，蛋白酶活力則開始下降.因此，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比選擇1GA6FA1較適宜.

2.2.3 乳酸pH值對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響 在發(fā)酵時間60 h，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比1GA6FA1條件下，

不同的乳酸pH值對混合菌種發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的影響如圖4所示.由圖4可知，當(dāng)pH值不斷升高時，分泌蛋白酶的活力呈現(xiàn)先遞增后減少的趨勢.當(dāng)pH為3.5時，蛋白酶活力達到最大，接近 28 U/mL.原因可能是隨著乳酸pH值的增大，酸度逐漸下降，霉菌的生長繁殖速度不斷加快，且適當(dāng)?shù)膒H值能夠有效抑制雜菌生長，蛋白酶活力也不斷增強.而當(dāng)pH值繼續(xù)增加時，蛋白酶活力不斷減少，這可能是由于酸度不斷降低，乳酸對雜菌的抑制力也相應(yīng)降低.因此，乳酸pH值選擇3.5為宜.

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化混合菌種發(fā)酵腐乳前發(fā)酵條件試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，以蛋白酶活力為指標(biāo)，選取發(fā)酵時間（A）、毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比（B）和乳酸pH值（C）3個因素，使用Design＼|Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計.因素與水平表和試驗結(jié)果分別見表1和表2.

利用Design＼|Expert8.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析，以蛋白酶活力為因變量（Y），以發(fā)酵時間（A）、毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比（B）和乳酸pH值（C）為自變量，得到的回歸方程為

Y=48.34+0.51A-0.77B+0.48C+0.78AB+0.36AC+0.41BC-9.70A2-3.94B2-4.49C2

偏回歸系數(shù)方差分析結(jié)果見表3.

由表3可知，所選擇的模型其不同處理間差異具有高度顯著性（P<0.000 1），即用回歸方程來體現(xiàn)各個變量因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其自變量與因變量之間的線性關(guān)系顯著，說明該試驗方法可信.失擬項0.226 5>0.05，表明回歸方程的試驗擬合較好，試驗過程中出現(xiàn)的誤差較小.校正系數(shù)R2Adj=0.994 1，即該模型能解釋99%的響應(yīng)值變化.通過F值可以看出各個因素在試驗中對協(xié)同發(fā)酵腐乳前發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶效果的影響大小順序為：毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比>發(fā)酵時間>乳酸pH值.

2.3.2 雙因子效應(yīng)分析結(jié)果

基于回歸方程和回歸模型方差分析表得到的各因素交互作用的響應(yīng)面變化三維曲面圖和等高線如圖5所示.由圖5可知，前發(fā)酵過程中，當(dāng)乳酸pH值固定時，隨著發(fā)酵時間和毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比的遞增，蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.由兩因素交互作用的3D圖是凸型且等高線呈橢圓形可知，兩因素之間交互作用較強.當(dāng)毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比固定時，隨著發(fā)酵時間和乳酸pH值的遞增，蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;當(dāng)發(fā)酵時間固定時，隨著乳酸pH值和毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比的遞增，蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.圖5b）和c）的等高線為圓形，說明發(fā)酵時間與乳酸pH值、毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比和乳酸pH值之間的交互作用不顯著，與回歸模型方差分析表反映的結(jié)果一致.綜上，由此回歸模型得出前發(fā)酵較優(yōu)條件為發(fā)酵時間60.28 h，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比1GA6FA1.18，乳酸pH值3.53，該條件下腐乳的蛋白酶活力響應(yīng)曲面出現(xiàn)最高點，其預(yù)測值為48.38 U/mL.

2.3.3 最佳前發(fā)酵條件的確定與驗證

為了驗證模型的有效性，考慮到實際情況，將較優(yōu)條件修改為發(fā)酵時間60 h，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5，與單因素試驗結(jié)果大致吻合.利用此發(fā)酵條件進行3次腐乳前發(fā)酵實驗，測得蛋白酶活力的平均值為48.015 U/mL，與預(yù)測值接近，說明此模型能較好地預(yù)測腐乳的蛋白酶活力.

2.4 腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸態(tài)氮的變化規(guī)律

圖6為腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化情況.由圖6可知，腐乳在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢.前發(fā)酵過程中由于霉菌生長繁殖分泌蛋白酶，氨基酸氮含量出現(xiàn)小幅上升;腌制階段由于高濃度食鹽有抑制酶活力的作用，游離氨基酸態(tài)氮上升不明顯;進入后發(fā)酵后，腐乳中游離氨基酸氮含量快速上升然后趨于平緩.腐乳中的游離氨基酸是蛋白質(zhì)降解的最終產(chǎn)物，腐乳的滋味與其含量密切相關(guān)，行業(yè)標(biāo)準規(guī)定每100 g腐乳中氨基酸態(tài)氮含量不低于0.42 g，即達到基本成熟.由圖6可知，腐乳在后發(fā)酵30 d時達到基本成熟標(biāo)準，此時每100 g腐乳中氨基酸態(tài)氮含量為0.53 g，與多數(shù)報道中單菌發(fā)酵40～50 d腐乳才基本成熟相比，周期大大縮短，說明混合菌種發(fā)酵有利于縮短腐乳的發(fā)酵周期.

2.5 腐乳發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)特性的變化規(guī)律

2.5.1 腐乳發(fā)酵過程中硬度的變化

圖7為腐乳發(fā)酵過程中硬度的變化情況.由圖7可知，腐乳后發(fā)酵30 d腐乳坯的硬度比白坯下降了31.97%.在發(fā)酵的過程中，前酵階段由于霉菌菌絲的包裹，腐乳毛坯的硬度增大;腌制過程中，由于食鹽的加入導(dǎo)致水分析出，腐乳的硬度直線上升;進入后發(fā)酵時段，腐乳的硬度與腐乳各成分含量存在一定的相關(guān)性，與腐乳降解程度相關(guān)，蛋白質(zhì)降解造成腐乳坯體變?nèi)彳?，并且后發(fā)酵過程中植物油的浸泡與滲透也促使坯體硬度迅速減小.

2.5.2 腐乳發(fā)酵過程中彈性的變化

圖8為腐乳發(fā)酵過程中彈性的變化情況.由圖8可知，在腐乳發(fā)酵過程中，彈性變化呈現(xiàn)逐漸減小趨勢.前發(fā)酵階段，毛坯外部被菌絲緊密包裹，硬度有所增加，彈性減小但幅度不大;腌坯階段，彈性減小是由于高鹽濃度使鹽坯硬度增加，導(dǎo)致彈性降低;后發(fā)酵階段，由于大分子物質(zhì)在各種酶系的催化作用下逐漸降解為小分子物質(zhì)，使得腐乳坯逐漸變得松軟，彈性逐漸減小，后發(fā)酵30 d時，腐乳坯的彈性較白坯下降了72.11%.

2.5.3 腐乳發(fā)酵過程中黏附性的變化

圖9為腐乳發(fā)酵過程中黏附性的變化情況.腐乳的黏附性與大豆蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，腐乳發(fā)酵過程中，隨著蛋白質(zhì)的降解，凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，使得腐乳越來越軟，從而黏附性越來越大.

由圖 9可知，腐乳后發(fā)酵30 d腐乳坯的膠黏性比白坯增加了74.07%.前發(fā)酵和腌制階段由于酶系的作用不明顯，黏附性的變化不顯著;進入后發(fā)酵階段，酶系作用增強，使得腐乳的黏附性顯著增大，隨著后發(fā)酵的進行，蛋白質(zhì)降解速率減緩，腐乳黏附性的變化也逐漸趨于平緩.

2.6 腐乳發(fā)酵過程中的色度變化

表4為腐乳發(fā)酵過程中的色度變化情況.由表4可以看出，腐乳的明度隨著發(fā)酵時間延長而不斷降低，在前發(fā)酵過程中，由于毛坯外裹一層帶有少許孢子的菌絲，因而明度降低;在后發(fā)酵過程中，明度進一步降低，這是因為隨著發(fā)酵時間的延長和蛋白質(zhì)脂肪的酶解，微觀結(jié)構(gòu)粒度變?nèi)?，對于光的反射變?nèi)?，?dǎo)致腐乳明度降低[20].此外，明度的降低還與加入調(diào)味料有關(guān).腐乳的黃度隨著發(fā)酵時間延長而不斷升高，在前發(fā)酵中，黃度升高的主要原因在于大豆異黃酮類物質(zhì)在微生物分泌的氧化酶作用下生成羥基化合物，該化合物呈黃色，所以毛坯變黃.腐乳的紅度隨著發(fā)酵時間延長逐漸升高，在前發(fā)酵階段小幅升高，后發(fā)酵階段大幅升高，這是因為后發(fā)酵時鹽坯裹上了辣椒粉調(diào)料，隨著浸泡時間的延長，紅度逐漸升高.后發(fā)酵30 d的腐乳其色差值較為接近市售潤豐油腐乳，表明腐乳表觀品質(zhì)良好.

3 結(jié)論

本文從腐乳毛坯中分離得到毛霉M/T，以蛋白酶活力為指標(biāo)，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化毛霉40899和毛霉M/T混合發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵工藝，并在最優(yōu)前發(fā)酵條件下考察混合菌種發(fā)酵腐乳過程中氨基酸態(tài)氮、質(zhì)構(gòu)特性和色度的變化規(guī)律.混合菌種發(fā)酵腐乳的最佳前發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間60 h，毛霉40899與毛霉M/T質(zhì)量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5.在此條件下前發(fā)酵的腐乳經(jīng)后發(fā)酵30 d后，每100 g腐乳中氨基酸態(tài)氮含量為0.53 g，達到腐乳行業(yè)標(biāo)準中基本成熟的規(guī)定，且腐乳硬度、黏附性、彈性和色度指標(biāo)良好.因此，毛霉40899和毛霉M/T混合發(fā)酵不僅能提高腐乳發(fā)酵優(yōu)勢菌株的豐富度，且在不影響腐乳品質(zhì)指標(biāo)的前提下縮短發(fā)酵周期.

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