劉繼紅， 尹 芳， 王昌梅， 趙興玲， 吳 凱， 柳 靜， 楊 紅， 劉士清， 張無敵

(云南師范大學(xué)， 云南 昆明 650500)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)是一種人參屬雙子葉被子植物[1]，喜生長于溫暖、避光、陰濕的環(huán)境[2,3]。三七主要成分與人參相似，包括氨基酸、糖類、皂苷、揮發(fā)油、黃銅、微量元素等[4]，從而決定三七具有廣泛的藥用價值[5]，是一種馳名中外的名貴藥材。但目前因三七獨特的生長環(huán)境和栽培方式，其復(fù)種年限增長且無明顯效果，再加上三七農(nóng)的不合理施肥和用藥。導(dǎo)致栽培三七的土壤中各種土傳病菌繁殖和流行，尤其是三七根腐病，造成三七連作障礙加劇，嚴重影響了三七植株的正常生長[6,7]。經(jīng)研究鑒定顯示，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)就是導(dǎo)致三七根腐病的主要病原菌[8]。

沼氣是有機物質(zhì)秸稈、雜草、人畜糞便、垃圾、污泥等，在厭氧條件下，多種微生物對其進行分解厭氧代謝的產(chǎn)物。沼液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)、水解酶、B族維生素、氨基酸、植物激素、抗生素和腐殖酸等，是一種很好的有機液肥，和生物農(nóng)藥[9-10]。另外許多研究顯示，沼液對多種植物病原菌都有很好的抑制效果。但目前還未出現(xiàn)將沼液應(yīng)用到防治三七根腐病病原菌的相關(guān)案例。

目前防治三七根腐病的措施有很多，包括農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等[7]，雖然這些措施在防治三七根腐病上具有各自的優(yōu)勢，但是依然不具有持久、有效的防治效果。鑒于目前還沒有用沼液來防治三七根腐病病原菌的相關(guān)研究，為了探究沼液中活性物質(zhì)對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果，本實驗采用6種不同極性的有機溶劑(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚)對沼液去除80%水分以后的濃縮液進行萃取再濃縮，旨在于探究出能否萃取濃縮出對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制效果的物質(zhì)，從而增強沼液抵抗尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的能力。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試病原菌

實驗所用尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌由云南師范大學(xué)能環(huán)學(xué)院農(nóng)村能源重點實驗室(該室分離提純并鑒定的菌株)所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

實驗室采用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基[11]。采用馬鈴薯為培養(yǎng)基，配方為：馬鈴薯200 g(去皮切成1 cm 左右的正方體小塊后煮30 min，過濾取清液用)，葡萄糖25 g，瓊脂13 g，加水至1000 mL，不調(diào)節(jié)pH值。

1.1.3 藥品

葡萄糖、瓊脂條、乙醇、乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚

1.1.4 儀器

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵、101型鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-1D型超凈工作臺、GH-400BC隔水式恒溫培養(yǎng)箱、GMSX-280手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐、燒杯、玻璃棒、紗布、培養(yǎng)皿、無菌打孔器、鑷子、接種環(huán)。

1.1.5 供試沼液

取自玉溪一沼氣工程的豬糞發(fā)酵沼液

1.2 方法

1.2.1 沼液的處理方法

用雙層紗布過濾，將大顆粒懸浮物濾去，待做濃縮實驗

1.2.2 試驗方法

(1)先在T=60℃，P=0.075-0.08 MPa使沼液去掉80%的水分[12]；

(2)待濃縮液冷卻至室溫后，用濃縮液和6種有機溶劑(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚)1∶2的比例進行單獨萃取；

(3)萃取分液后，用T≤60℃，P≤0.07 MPa來回收有機溶劑；

(4)待萃取物冷卻后，用來做抑菌試驗；

(5)抑菌試驗：將供試菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長滿整個平板，放置備用。接著將萃取物、萃取后剩余物、有機溶劑、濃縮液、原沼液、無菌水分別依次取500 uL于平板表面涂布均勻，用打孔粘貼法進行抑制尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的實驗。取布滿供試尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的PDA培養(yǎng)基平板，用無菌打孔器(φ=9 mm)對平板進行菌斑打孔，接著用鑷子小心地將菌種塊移入不同抑菌液處理的平板上，菌絲一面朝上，每個培養(yǎng)皿中放入3小塊菌種，并呈三角形放于平板中央，加蓋并標記，放于30℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h觀察測量菌斑的直徑[13,14]。

(6)待培養(yǎng)24 h以后，用十字交叉法測量菌塊生長的大小。之后每24 h對菌塊進行一次測量，一共測量4 d的數(shù)據(jù)[13,14]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

抑制菌絲生長率計算采用生長速率法[13-14]。

抑制數(shù)(cm)=對照平板培養(yǎng)基上菌落直徑-處理平板培養(yǎng)基上

菌落直徑

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液萃取成分對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果對比研究

不同極性的6種有機萃取劑對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有不一樣的抑菌效果，抑制效果如圖1、圖2所示：

圖1 不同有機溶劑對尖孢鐮刀菌的抑制效果

圖2 不同有機溶劑對腐皮鐮孢菌的抑制效果

從圖1來看，不同有機溶劑對尖孢鐮刀菌具有不同的抑制效果。隨著培養(yǎng)時間的延長，環(huán)己烷的抑制效果呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，第1天為抑制效果的峰值；其中，甲苯、乙酸乙酯、苯、石油醚對尖孢鐮刀菌的抑制效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在培養(yǎng)第2天出現(xiàn)抑制效果的峰值；其中甲苯對尖孢鐮刀菌具有較強的抑制效果，高達51%。

從圖2可看出，甲苯、乙酸乙酯、環(huán)己烷、乙醚4種有機溶劑對腐皮鐮孢菌的抑制效果隨培養(yǎng)時間的增加而下降；苯和石油醚對腐皮鐮孢菌的抑制效果隨培養(yǎng)時間的增長，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢并在第3天達到抑菌峰值；其中甲苯的抑制效果最強，高達31%。

2.2 不同有機溶劑萃取成分對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果

不同有機溶劑萃取得到的物質(zhì)對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌抑菌效果的影響如圖1和圖2所示。

由圖3和圖4可看出，各有機溶劑萃取物都對兩種病原菌具有較好的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時間的增長，萃取物的抑菌效果也逐漸增強，但濃縮液和原沼液對兩種病菌的抑制效果隨著培養(yǎng)時間的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。從兩個圖可看出，乙醚萃取得到的萃取物抑制效果最佳，最高可達71%，原沼液和無菌水對照的抑菌效果相對較差。從而也說明沼液經(jīng)有機溶劑萃取濃縮后，抑菌效果得到提高，也說明有機溶劑能提取出抑菌活性物質(zhì)加強其抑菌能力。

圖3 不同有機萃取劑萃取物對尖孢鐮刀菌的抑菌效果

圖4 不同有機萃取劑萃取物對腐皮鐮孢菌的抑菌效果

2.3 不同有機溶劑萃取后剩余物對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果

不同有機萃取劑萃取濃縮液后的剩余物對尖孢鐮刀菌具有較弱的抑制效果，抑菌效果如圖5所示。

由圖5和圖6可看出，隨著培養(yǎng)時間的增加不同有機萃取劑萃取剩余液對尖孢鐮刀菌的抑制效果均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在第4天時，所有萃取剩余物都失去對尖孢鐮刀菌的抑制效果，抑菌率均下降為0%，各萃取剩余物均失去抑菌效果。

圖5 不同萃取劑萃取剩余物對尖孢鐮刀菌的抑制效果

圖6 不同萃取劑萃取剩余物對腐皮鐮孢菌的抑制效果

2.4 各處理之間的差異性分析

2.4.1 對沼液的不同處理對尖孢鐮刀菌抑制效果的差異性分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，可見表1。

表1 各處理間方差分析

從表1可看出，p<0.05各處理間存在明顯差異(具有顯著極差)。也說明沼液在萃取濃縮前后抑菌效果變化較大，其中乙醚萃取物的抑菌效果最強，達到71%。但是其余5種有機溶劑萃取物的抑菌效果都相差不大，都在70%左右。說明萃取濃縮可增大沼液中活性物質(zhì)的濃度，增強沼液的抑菌能力。

表2 各處理間的多重比較分析

注：5%顯著水平用小寫字母標記；對于不同處理，字母標記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如ab與ab，字母標記不同的數(shù)據(jù)間存在顯著差異，例如a與bc，字母標記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異，例如a與ab。1%極顯著水平用大寫字母標記；對于不同處理，字母標記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如A與A，字母標記不同的數(shù)據(jù)間差異達到極顯著水平，例如A與B，字母標記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在極顯著差異，例如A與AB。

由表2可以看出，萃取物和萃取剩余物、原沼液、濃縮液及無菌水對照之間的抑菌率存在極顯著差異性。其中屬乙酸乙酯萃取物對尖孢鐮刀菌的平均抑菌效果最強，達56%?？偟膩碚f各有機萃取劑的萃取物之間抑菌效果并無顯著差異性，但和萃取剩余物抑菌效果之間卻存在顯著差異性，從而也說明6種不同極性的有機萃取劑都能提取出具有對尖孢鐮刀菌抑制效果的活性物質(zhì)。

2.4.2 對沼液的不同處理對腐皮鐮孢菌抑制效果的差異性分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，見表3。

表3 各處理間方差分析

由表3可知，p<0.05，說明各處理間對腐皮鐮孢菌的抑菌效果存在顯著差異性。其中要屬乙醚萃取物的抑菌效果最好，最高可達71%。無菌水對照組抑菌效果最差，甚至出現(xiàn)了促進生長的作用。

表4 各處理間的多重比較分析

注：5%顯著水平用小寫字母標記；對于不同處理，字母標記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如ab與ab，字母標記不同的數(shù)據(jù)間存在顯著差異，例如a與bc，字母標記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異，例如a與ab。1%極顯著水平用大寫字母標記；對于不同處理，字母標記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如A與A，字母標記不同的數(shù)據(jù)間差異達到極顯著水平，例如A與B，字母標記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在極顯著差異，例如A與AB。

由表4可知，各萃取物和萃取剩余物、濃縮液、原沼液對腐皮鐮孢菌的抑菌效果存在極顯著差異性?？偟膩碚f，苯萃取物對腐皮鐮孢菌的平均抑菌效果最佳，達59%。說明對腐皮鐮孢菌具有最佳抑菌效果的萃取活性物質(zhì)和乙酸乙酯具有極相似性。但各萃取物之間對腐皮鐮孢菌的抑制效果并無明顯差異性，且萃取物的抑菌效果和萃取剩余物之間對腐皮鐮孢菌的抑制效果存在極顯著差異性，從而也說明每一種有機萃取劑都能從濃縮液中提取到對腐皮鐮孢菌有抑制效果的活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

6種有機萃取劑都對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有一定的抑制效果，且抑制效果隨培養(yǎng)時間的增長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，主要原因是有機溶劑在30℃環(huán)境中逐漸蒸發(fā)，導(dǎo)致抑制效果變?nèi)酢?/p>

經(jīng)6種有機萃取劑萃取過后剩余的液體對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有較弱的抑制效果，但在培養(yǎng)3 d后抑菌效果下降迅速，第4天時抑菌率下降為0%。

6種有機萃取劑萃取濃縮液對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有較強的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時間的增加，抑菌效果逐漸增強。另外經(jīng)萃取提取的物質(zhì)的抑菌效果強于濃縮液、原沼液、有機萃取劑及無菌水。不同有機萃取劑得到的萃取物的抑菌效果之間并無顯著差異性，說明每種有機萃取劑都能萃取出對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制效果的活性物質(zhì)。

綜上結(jié)果可知：各有機萃取劑都能在沼液中提取到對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制作用的物質(zhì)，從而使沼液經(jīng)不同有機萃取劑萃取濃縮后抑菌效果大大加強，最高抑菌率≥60%。各有機溶劑萃取得到的萃取物之間的抑菌效果雖無顯著差異性，但總體來說乙醚萃取物抑菌效果最佳，最高抑菌率可達71%。同時萃取過后的剩余液體并無明顯的抑菌效果，經(jīng)萃取前后對比也可看出：有機萃取劑的確是將沼液中的某些抑菌活性物質(zhì)從沼液濃縮液中萃取濃縮，使萃取剩余物基本失去了抑菌能力。