周運(yùn)迪，吳星星，趙海萍，羅大極

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.中國科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072）

性腺分化（Gonadal differentiation）指動(dòng)物性腺原基經(jīng)一系列精確、程序化的發(fā)育，最終形成有生物學(xué)功能的精巢或卵巢的過程，是生命科學(xué)研究的核心問題，一直備受科研人員關(guān)注。魚類有極為豐富的物種多樣性和龐雜的性別決定方式，普遍存在顯著的兩性生長差異，生長是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，生殖是優(yōu)良養(yǎng)殖品種培育和擴(kuò)群應(yīng)用的基礎(chǔ)，由此魚類的性別相關(guān)研究既關(guān)乎生長這一優(yōu)良性狀又關(guān)乎品種繁殖。因此，魚類性腺分化與發(fā)育相關(guān)研究有深遠(yuǎn)的基礎(chǔ)理論意義及廣泛的應(yīng)用前景。青鳉（Oryzias latipes）作為一種重要的模式魚類，有胚胎發(fā)育易于觀察、易于顯微操作、適于基因編輯等特點(diǎn)。另外，青鳉屬于XX/XY型性別決定類型的魚類[1]，是第1種已克隆與鑒定雄性性別決定基因的魚類，其性別決定基因是DMY（也稱dmrt1bY）基因[2-3]，是研究性腺分化與發(fā)育的良好材料[4]。

FOXL2（Forkhead box L2）為Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員[5-6]。最初，F(xiàn)OXL2基因在瞼裂病/眼瞼下垂/內(nèi)眼角贅皮綜合征（Blepharophimosis/ptosis/ epicanthus inversus syndrome，BPES）患者中被克隆，隨后報(bào)道了部分BPES患者存在卵巢發(fā)育障礙[7-8]，提示FOXL2基因在性腺發(fā)育中的功能。研究顯示，敲除山羊Foxl2基因后突變動(dòng)物的性腺會(huì)發(fā)生卵巢向精巢轉(zhuǎn)變[9-10]。小鼠Foxl2缺失導(dǎo)致卵巢早衰，卵泡的維持和粒層細(xì)胞發(fā)育異常，以及Dmrt1和Sox9等精巢發(fā)育與功能維持關(guān)鍵基因表達(dá)上升[11-13]。越來越多的研究顯示，F(xiàn)oxl2主要在哺乳動(dòng)物的卵巢粒層細(xì)胞中表達(dá)，是卵巢分化和維持過程中的關(guān)鍵基因[14-15]。然而，foxl2基因在低等脊椎動(dòng)物中的功能研究與相關(guān)機(jī)制研究尚少。受限于魚類基因操作技術(shù)，較長一段時(shí)間曾難以深入研究魚類中基因調(diào)控的分子機(jī)制，因此，青鳉foxl2基因研究主要集中在表達(dá)模式等方面[16-17]。

近年來，基因編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，其中包括鋅指核酸酶技術(shù)[18]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)[19]和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列基因編輯技術(shù)（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9），為基因功能研究提供了新方法[20]。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)因操作簡單、成本較低、敲除效率較高和靶位點(diǎn)選擇性廣等優(yōu)點(diǎn)而廣泛運(yùn)用于各種動(dòng)物基因編輯研究[21-23]。本研究用 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除青鳉foxl2基因，建立青鳉foxl2基因突變體材料，為深入闡釋foxl2基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

青鳉，Orange品系，由新加坡國立大學(xué)洪云漢教授贈(zèng)予。在中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育，于 26 ℃下恒溫養(yǎng)殖，光暗周期比為14∶10。實(shí)驗(yàn)按照中國科學(xué)院水生生物研究所實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2 foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

根據(jù) CRISPR/Cas9靶序列設(shè)計(jì)網(wǎng)站信息（http://zifit.partners.org/ZiFiT/），設(shè)計(jì)foxl2基因敲除的靶位點(diǎn)。提交foxl2基因序列（NM_001104888.1）信息，通過網(wǎng)站獲得所有緊鄰5′ -NGG-3′ （PAM）的候選gRNA靶序列集合，選取青鳉foxl2基因起始密碼子ATG后評分最高的兩條gRNA在基因上的位置信息，進(jìn)行體外合成和胚胎顯微注射試驗(yàn)。

1.3 foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)gRNA及Cas9 mRNA的合成

pT7-gRNA質(zhì)粒和 pT3-Cas9質(zhì)粒[23]購自Addgene。以pT7-gRNA質(zhì)粒作為模板，設(shè)計(jì)PCR引物（表1），所用引物均在北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（武漢）合成，擴(kuò)增獲得攜帶 T7啟動(dòng)子、foxl2基因靶位點(diǎn)序列和gRNA序列，PCR產(chǎn)物通過割膠回收純化，送鉑尚生物技術(shù)有限公司（武漢）測序，比對正確后，通過試劑盒（mMESSAGE mMACHINE? T7 Transcription Kit，Ambion，USA）體外轉(zhuǎn)錄合成，獲得foxl2基因靶位點(diǎn)和gRNA序列的 mRNA。pT3-Cas9質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切線性化后，通過試劑盒（mMESSAGE mMACHINE? T3 Transcription Kit，Ambion，USA）體外轉(zhuǎn)錄合成 Cas9 mRNA。將mRNA純化，測定RNA濃度，保存在- 80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及其序列Table 1 Primers and their sequences

1.4 青鳉胚胎的顯微注射

采用定量顯微注射系統(tǒng)（Warner PLI-100A，USA）[24]，將2個(gè)foxl2基因靶位點(diǎn)的gRNA分別與Cas9 mRNA以質(zhì)量體積比（ng/μL）50∶500混合，分別注射青鳉一胞期的受精卵，每個(gè)位點(diǎn)注射不少于200枚受精卵，注射后胚胎在26 ℃下培養(yǎng)，用于后期檢測與傳代。

1.5 foxl2基因突變體的篩選與傳代

注射72 h后，隨機(jī)收集8枚青鳉胚胎，提取基因組 DNA，采用異源雙鏈分析法（Heteroduplex Analysis，HA）[25]檢測P0 代foxl2基因 CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)的突變效率，PCR擴(kuò)增后，測序驗(yàn)證。注射胚胎發(fā)育為成體后，剪取少量尾鰭，通過HA法篩選出P0代中的突變個(gè)體。因?yàn)镻0代的陽性魚是嵌合體，尾鰭檢測到foxl2基因突變，生殖腺中foxl2基因不一定突變；尾鰭與生殖腺中的foxl2基因突變類型也不一定相同。因此，將每一對 P0代的親本通過雌雄配對與野生型（Wild type，WT）交配獲得F1代群體獨(dú)立飼養(yǎng)。F1代發(fā)育成熟后，提取尾鰭DNA，PCR結(jié)合測序確定foxl2基因突變后的基因型，選擇突變類型為堿基缺失數(shù)目為非3整數(shù)的個(gè)體，造成foxl2基因編碼區(qū)發(fā)生移碼突變或提前終止翻譯的類型作為傳代的親本類型。選擇突變后基因型相同的父母本雜交獲得F2代群體，在F2代中篩選可獲得的foxl2-/-純合子個(gè)體和foxl2+/-雜合子個(gè)體，同理，產(chǎn)生 F3代群體，用于后續(xù)遺傳建系和實(shí)驗(yàn)分析。

剪取少量尾鰭，提取基因組 DNA，通過 PCR擴(kuò)增和測序分析foxl2基因突變體的基因型，并通過擴(kuò)增DMY基因分析突變體的性染色體類型[26]。根據(jù)性別決定類型，青鳉為雄性異配型性別決定方式，即簡單表述為XX型雌性與XY型雄性。在F1代群體中檢測有野生型XX型雌性、野生型XY型雄性、雜合突變體XX型雌性（foxl2+/-）、雜合突變體XY型雄性（foxl2+/-）。在 F2代群體中檢測有野生型XX型雌性、野生型XY型雄性、雜合突變體XX型雌性（foxl2+/-）、雜合突變體XY型雄性（foxl2+/-）、純合突變體 XX型（foxl2-/-）和純合突變體 XY型（foxl2-/-）。

1.6 形態(tài)學(xué)分析

Orange品系青鳉雌性與雄性的背鰭與臀鰭形狀有顯著差異[26]，雄性臀鰭呈平行四邊形，雌性臀鰭呈三角形，通過觀察臀鰭形狀初步判斷成年青鳉的性別。將青鳉成魚麻醉，于體式鏡（Olympus SZ61，JPN）下拍照，統(tǒng)計(jì)并分析群體中雌雄比例。

1.7 組織學(xué)分析

按照中國科學(xué)院水生生物研究所和武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指導(dǎo)原則對青鳉解剖與處理，將剖取的腺組織分成2份，一份放入Trizol試劑（Invitrogen，USA）用于提取 RNA，一份放入波恩氏液[V(苦味酸)∶V(甲醛) ∶V(冰醋酸) =15∶5∶1）]中固定 12 h，脫水，石蠟包埋，切片（切片厚度精巢6 μm，卵巢8 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹脂封片，于顯微鏡（Olympus BX53，JPN）下觀察、記錄與比較分析。

1.8 基因表達(dá)分析

提取 1.7中的性腺組織總 RNA，用 ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo，JPN）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）： 2×SYBR Green Mix 10 μL，正、反向引物各 0.5 μL（終濃度 0.2 μmol/L），cDNA 模板 2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃ 15 s；繪制熔解曲線，65 ～ 95 ℃，5 s/0.5 ℃。β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法分析相關(guān)基因的相對表達(dá)[27]，通過GraphPad Prism 7軟件可視化作圖，相關(guān)基因的定量引物見表1。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示，并采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)，0.01＜P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 青鳉foxl2基因敲除突變體材料的建立

青鳉foxl2基因敲除突變體材料建立流程見圖1。根據(jù) CRISPR/Cas9靶序列設(shè)計(jì)網(wǎng)站確定青鳉foxl2基因候選CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)，如圖2所示。通過提取DNA后PCR與測序的方法檢測F1代的突變類型（圖3），篩選出缺失4堿基基因型（Δ4 bp）的陽性魚作為親本，建立本研究的突變體材料。野生型FOXL2蛋白全長為306個(gè)氨基酸，F(xiàn)orkhead 結(jié)構(gòu)域位于FOXL2蛋白的47至135位氨基酸，Δ4 bp突變型的foxl2基因預(yù)測僅可產(chǎn)生13個(gè)氨基酸的多肽鏈，在Forkhead結(jié)構(gòu)域前終止（圖4），不能編碼全長FOXL2蛋白的氨基酸序列，提示foxl2基因Δ4bp突變型不具備正常功能。

圖1 青鳉foxl2基因敲除突變體材料的實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Flow chart of generating foxl2 mutants in Medaka

2.2 青鳉foxl2基因純合突變體的篩選與表型分析

圖2 青鳉foxl2基因的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structure of foxl2 gene in Medaka

圖3 青鳉foxl2基因CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)突變類型Fig.3 Target mutation type of foxl2 gene CRISPR/Cas9 in Medaka

圖4 青鳉foxl2基因缺失4堿基基因型的氨基酸序列預(yù)測與比對Fig.4 Prediction and comparison of the amino acid sequence of foxl2 gene with 4 base deletion in Medaka

選取foxl2-F和foxl2-R、foxl2-F1和foxl2-R1引物分別擴(kuò)增F2代和F3代群體中每尾魚的foxl2基因，篩選foxl2基因突變的雜合子與純合子。圖5中，引物foxl2-F1和foxl2-R1 的PCR產(chǎn)物為497 bp，foxl2-F和foxl2-R的產(chǎn)物為322 bp，foxl2基因的PCR產(chǎn)物中，編號(hào)為2、4、5和8的樣品既有497 bp又有 322 bp條帶，說明該魚是野生型或突變型雜合子；編號(hào)為1、3、6和7號(hào)的樣品有322 bp但無497 bp條帶，說明該魚是突變型。為確認(rèn)檢測對象的遺傳性別，通過擴(kuò)增DMY基因判斷檢測對象的性染色體類型，DMY-F和DMY-R的 PCR產(chǎn)物為396 bp，即通過有無DMY基因PCR產(chǎn)物判斷是否攜帶Y染色體，從而判斷檢測對象的遺傳性別。如圖5所示，編號(hào)1、4和5號(hào)的青鳉為XX型性染色體，而編號(hào)2、3、6、7和8號(hào)的青鳉為XY型性染色體。

圖5 foxl2和DMY基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification result of foxl2 and DMY gene

為進(jìn)一步驗(yàn)證foxl2基因突變型個(gè)體的基因型是否為純合子，對foxl2基因PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果見圖6，驗(yàn)證后的突變型純合子用于后續(xù)功能研究。進(jìn)一步研究foxl2-/-突變體的生理性別是否與檢測的性染色體類型相符，foxl2-/-突變體的生理性別通過臀鰭形狀初步判斷，臀鰭呈三角形為雌性，臀鰭呈平行四邊形為雄性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖7。檢測野生型青鳉共計(jì)121尾，其中雌魚59尾，雄魚62尾，它們的生理性別與遺傳性別相符。然而，檢測的34尾foxl2-/-突變體遺傳性別無論是XX型還是XY型，其臀鰭形狀均顯示為雄性。各隨機(jī)取3尾foxl2-/-突變體，解剖后發(fā)現(xiàn)其性腺不具備典型的卵巢特征（圖7），提示foxl2-/-突變體的生理性別均為雄性。

圖6 野生型與突變型純合子的foxl2基因DNA測序Fig.6 foxl2 gene DNA sequencing of wild-type and mutant homozygous

圖7 野生型與突變型純合子性別比例統(tǒng)計(jì)Fig.7 Sex ratio statistics of wild-type and mutant homozygous

圖8 野生型與突變型純合子青鳉的表型Fig.8 Phenotypes of wild-type and mutant homozygous in Medaka

2.3 foxl2基因缺失對青鳉性腺的影響

獲得foxl2-/-純合子后，用組織切片分析foxl2缺失對青鳉性腺結(jié)構(gòu)的影響（圖9）。與野生型青鳉卵巢和精巢比較發(fā)現(xiàn)，foxl2-/-純合子無論性染色體類型是XX型還是XY型，其性腺整體結(jié)構(gòu)與精巢組織更為相似。值得注意的是，與野生型精巢不同，foxl2-/-純合突變體的精巢形態(tài)不規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)疏松，還發(fā)現(xiàn)極少數(shù)核仁外周卵母細(xì)胞和退化的核仁外周卵母細(xì)胞（圖9：1-8），表明foxl2缺失影響青鳉卵巢組織結(jié)構(gòu)的維持。

精巢和卵巢在生殖細(xì)胞與支持性細(xì)胞類型上均有顯著差異，因此，進(jìn)一步比較分析foxl2-/-純合突變體性腺組織中生殖細(xì)胞周圍的支持性細(xì)胞（圖9：9-16）。野生型青鳉卵巢中核仁外周卵母細(xì)胞周圍有一層緊密排列的長方形粒層細(xì)胞，野生型青鳉精巢中精小囊周圍有一些不規(guī)則三角形的支持細(xì)胞。著重觀察foxl2-/-純合子的性腺中核仁外周卵母細(xì)胞和支持性細(xì)胞類型，與野生型卵巢不同，雖然可觀察到極少數(shù)的核仁外周卵母細(xì)胞，但其周圍無正常形態(tài)的粒層細(xì)胞；同時(shí)，與野生型精巢相比，精小囊中各種精原細(xì)胞數(shù)目明顯減少，空腔顯著增多，值得一提的是，空腔周圍并無正常形態(tài)的粒層細(xì)胞。提示foxl2缺失可能主要影響青鳉卵巢組織結(jié)構(gòu)的維持，特別是粒層細(xì)胞分化與功能的維持。

圖9 青鳉性腺組織結(jié)構(gòu)Fig.9 Tissue section of gonad in Medaka

2.4 foxl2基因缺失對性腺分化與發(fā)育相關(guān)基因的影響

組織切片結(jié)果顯示，foxl2-/-純合突變體的性腺整體形態(tài)趨近于精巢，但精細(xì)結(jié)構(gòu)尤其是生殖細(xì)胞周圍體細(xì)胞類型不同于精巢，表明foxl2-/-純合突變體性腺的分化與發(fā)育出現(xiàn)了紊亂。為從分子水平驗(yàn)證這一推測，進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR檢測性腺分化與發(fā)育相關(guān)基因。選擇已報(bào)道的一系列與性腺分化與發(fā)育相關(guān)基因，其中精巢發(fā)育相關(guān)的基因sox9b、gsdf、amh以及卵巢發(fā)育相關(guān)基因cyp19a1a表達(dá)差異顯著（圖10）。為精細(xì)分析基因表達(dá)情況，充分考慮性染色體和基因組對基因表達(dá)的影響，將foxl2-/-純合突變體分為XX組和XY組，XX組表示性染色體類型為XX型青鳉性腺；XY組表示性染色體類型為XY型青鳉性腺。結(jié)果顯示，與野生型相比較，foxl2-/-純合突變體性腺中，sox9b基因的表達(dá)無論是XX組還是XY組均顯著升高（圖10A）；XX組的foxl2-/-純合突變體gsdf基因的表達(dá)顯著升高，XY組則無顯著差異（圖10B）；XX組的foxl2-/-純合突變體amh基因的表達(dá)增加極顯著，XY組則無顯著差異（圖10C）；XX組的foxl2-/-純合突變體cyp19a1a基因的表達(dá)降低極顯著，XY組則降低顯著（圖10D）?？梢姡琭oxl2-/-純合突變體性腺的基因表達(dá)情況均表現(xiàn)出精巢的分子特征，驗(yàn)證了組織切片結(jié)果。

圖10 性腺中sox9b、gsdf、amh和cyp19a1a基因的表達(dá)分析Fig.10 Expression of sox9b, gsdf, amh and cyp19a1a gene in the gonad of Medaka

3 討論

FOXL2是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員[5-6]。隨著魚類基因編輯技術(shù)的發(fā)展與成熟，越來越多的研究聚焦到魚類Fox轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能。近期，通過建立foxl2基因敲除的羅非魚（Oreochromis niloticus）材料揭示，foxl2基因通過調(diào)控雌性信號(hào)通路的cyp19a1等關(guān)鍵基因影響性腺分化與發(fā)育[28-30]；斑馬魚（Danio rerio）中，存在foxl2a和foxl2b兩個(gè)同源基因，單獨(dú)敲除foxl2a與foxl2b基因后性腺表型變化不顯著，而雜交獲得的foxl2a和foxl2b雙敲除材料中卵巢發(fā)育受阻，提示斑馬魚foxl2a和foxl2b協(xié)同調(diào)控卵巢發(fā)育與維持[31]。隨著硬骨魚中對foxl2基因功能的研究逐漸深入，foxl2基因?qū)︳~類卵巢分化和維持的重要作用得以證實(shí)。

CRISPR/Cas9技術(shù)有操作簡易、敲除效率高和靶位點(diǎn)選擇性廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除青鳉foxl2基因，建立了青鳉foxl2基因突變體材料，為后續(xù)深入闡釋foxl2基因功能提供良好的動(dòng)物模型和研究基礎(chǔ)。主要圍繞foxl2基因缺失4堿基基因型（Δ4bp）的陽性魚產(chǎn)生的雜合突變型與純合突變類型開展了表型、組織切片與基因表達(dá)分析。因?yàn)殡s合突變類型的表型不顯著，因而未在文中詳細(xì)展示與描述。對于純合子進(jìn)行了 DNA和cDNA水平的檢測，通過三聯(lián)密碼翻譯預(yù)測驗(yàn)證CRISPR/Cas9技術(shù)破壞了foxl2基因的正常翻譯，無法形成 FOXL2蛋白行使功能。因未獲得較好的FOXL2抗體，故未通過直接的實(shí)驗(yàn)證明foxl2-/-純合突變體中無FOXL2蛋白。

序列比對發(fā)現(xiàn)，foxl2基因在魚類中比較保守。但羅非魚在受精后5 d檢測到foxl2基因的表達(dá)[32]，呂宋青鳉（Oryzias luzonensis）在受精后7 d（即孵化前1 d）檢測到foxl2基因表達(dá)[33]，然而青鳉在孵化后0 d檢測到foxl2基因表達(dá)[16]，可見不同魚類foxl2基因的時(shí)空表達(dá)不盡相同。因此，建立青鳉foxl2基因敲除的突變體材料有助于全面揭示foxl2基因在脊椎動(dòng)物中的功能與分子機(jī)制。

本研究的性腺組織切片中，基因型為 XX的foxl2-/-突變體青鳉臀鰭等體征表現(xiàn)為雄性，即不具備典型卵巢特征而更像精巢，表明foxl2-/-突變體青鳉的性染色體與體征、性別存在不一致情況。為更精細(xì)揭示foxl2-/-突變體青鳉的表型，進(jìn)行后續(xù)功能研究，本研究通過臀鰭等體征和性腺組織特征分別報(bào)道青鳉的性別，并通過擴(kuò)增DMY基因判斷檢測對象的遺傳性別。由此，將foxl2-/-突變體青鳉分為XX型與XY型。檢測的34尾foxl2-/-突變體無論是XX型還是XY型的遺傳性別，其臀鰭形狀顯示其均為雄性，且解剖發(fā)現(xiàn)其性腺不具備典型的卵巢特征，提示foxl2-/-突變體的生理性別均為雄性。這與斑馬魚中雙敲除foxl2a和foxl2b[31]、羅非魚敲除foxl2報(bào)道突變體的雄性特征相似[29-30]。

本研究中，XX型的青鳉foxl2-/-突變體性腺整體結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為精巢特征，但仍殘留少量的核仁外周卵母細(xì)胞和退化的核仁外周卵母細(xì)胞，提示 XX型的foxl2-/-突變體存在卵巢發(fā)育不全或者卵巢退化現(xiàn)象。在羅非魚和斑馬魚foxl2敲除個(gè)體中觀察到退化的卵母細(xì)胞和空腔，與本研究類似[29,31]。進(jìn)一步觀察青鳉foxl2-/-突變體精巢，發(fā)現(xiàn)核仁外周卵母細(xì)胞周圍并無正常形態(tài)的粒層細(xì)胞，結(jié)合哺乳類與魚類的foxl2基因在性腺中的表達(dá)主要定位在粒層細(xì)胞[6,16,34]，提示青鳉foxl2基因的缺失導(dǎo)致核仁外周卵母細(xì)胞周圍的粒層細(xì)胞異常。而發(fā)生天然性逆轉(zhuǎn)魚類中foxl2的表達(dá)水平也隨著性別的轉(zhuǎn)換而發(fā)生卵巢粒層細(xì)胞與精巢支持細(xì)胞的改變[35-36]。本研究中，青鳉foxl2主要在粒層細(xì)胞及前體細(xì)胞中表達(dá)，為foxl2基因參與卵巢粒層細(xì)胞分化與功能的維持[16]提供又一佐證。

Sox9和Amh等與雄激素生成密切相關(guān)，直接影響性腺向精巢的分化與精巢的發(fā)育維持[37-38]，這從分子水平初步解釋本研究中青鳉foxl2-/-突變體性腺傾向于精巢的組織特征。大部分硬骨魚類中sox9基因有2種類型，即sox9a和sox9b/sox9a2[39-40]，性腺和精巢支持細(xì)胞中特異表達(dá)的是sox9b[41]。青鳉foxl2-/-突變體性腺中sox9b基因表達(dá)顯著增加，提示青鳉foxl2基因抑制sox9b表達(dá)，印證了哺乳動(dòng)物中的相關(guān)發(fā)現(xiàn)[42]，foxl2-/-突變體sox9b、amh和gsdf基因表達(dá)升高也表明性腺向精巢方向分化的趨勢增強(qiáng)。Cyp基因家族是編碼芳香化酶P450的重要組分，與雌激素的合成密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物中的研究顯示，F(xiàn)oxl2可直接調(diào)控Cyp19a1轉(zhuǎn)錄，參與雌激素合成，影響性別的分化與性腺的發(fā)育[43]。青鳉包括cyp19a1a/cyp19a1和cyp19a1b/cyp19a2[44-46]。在青鳉中，cyp19a1a主要在性腺中表達(dá)，與性腺分化相關(guān)[47]。羅非魚的研究表明，foxl2可通過結(jié)合cyp19a1啟動(dòng)子上的特異序列，激活cyp19a1的轉(zhuǎn)錄[28]。本研究中，foxl2-/-突變體中cyp19a1a的表達(dá)水平顯著降低，為突變體性腺雌性信號(hào)通路功能下降與卵巢維持功能下降提供了分子依據(jù)。青鳉cyp19a1a基因敲除研究也報(bào)道了突變體發(fā)育中出現(xiàn)卵巢向精巢方向的轉(zhuǎn)變[48]，但是，青鳉中foxl2是通過直接方式還是間接方式調(diào)控cyp19a1a，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)建立了青鳉foxl2-/-突變體，發(fā)現(xiàn)青鳉foxl2-/-突變體出現(xiàn)遺傳雌性生理雄性的特征。foxl2基因的缺失造成cyp19a1a等雌激素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)顯著下降，核仁外周卵母細(xì)胞退化和粒層細(xì)胞異常，卵巢功能退化；而sox9b、gsdf和amh等基因的表達(dá)顯著增加，foxl2-/-突變體性腺組織結(jié)構(gòu)上更像精巢。初步闡釋foxl2在維持青鳉卵巢功能中的作用，為后續(xù)深入闡釋foxl2基因的功能提供良好的動(dòng)物模型和研究基礎(chǔ)。