邢 晏，馮長煥，杜利君

(1.西華師范大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院，四川 南充 637000；2.南充市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川 南充 637000)

原發(fā)性肝癌(PHC)主要包括肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌(ICC)及 HCC-ICC 3大種類，是我國目前第4位常見惡性腫瘤及第3位腫瘤致死病因[1]. 我國每年約有11萬人死于肝癌,占全球肝癌死亡患者的45%[2].甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)來源于甲胎蛋白(AFP)，與異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)都是PHC特異性較高的腫瘤標(biāo)志物，AFP陽性HCC與AFP陰性HCC相比,惡性程度較高,預(yù)后較差[3].臨床上約有30%肝癌患者呈血清AFP陰性，而一些乙型肝炎和肝硬化患者血清AFP呈陽性，血清AFP的敏感性和特異性尚不能滿足臨床需求[4].PIVKA-Ⅱ 有助于HCC早期診斷.由于各種原因，肝癌組織能產(chǎn)生 PIVKA-Ⅱ并進(jìn)入血液[5-6]，但是PIVKA-Ⅱ結(jié)果受諸多因素影響，可能會給診斷PHC的特異度[7-8]帶來誤差.近年來研究[9-10]顯示，聯(lián)合檢測多種血清標(biāo)志物對肝癌診斷具有很好互補(bǔ)作用，尤其是對AFP的陰性患者.AFP作為較好的篩查指標(biāo)，單項(xiàng)檢測中，AFPd -L3特異度最高，PIVKA-Ⅱ靈敏度最高.將AFP，AFP-L3，PIVKA-Ⅱ三者聯(lián)合檢測可以大大提高HCC的診斷效能，彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測的不足[11].

全自動電泳熒光免疫分析儀μTASWakoi30正是通過使用LBA 法在液相中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后，分離并檢測形成的免疫復(fù)合體，實(shí)行AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ三聯(lián)合檢測，快速高效，極大地提高了檢測的敏感性與特異性，提升了早期HCC的診斷率.同時，也便于對HCC與BLD患者進(jìn)行鑒別診斷、療效評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測等.尤其在HCC高危人群監(jiān)測中，聯(lián)合檢測可以更早提示HCC的存在，從而實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，大大改善患者預(yù)后.為了驗(yàn)證儀器檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，給臨床提供快捷準(zhǔn)確的檢驗(yàn)報告及診斷依據(jù)，筆者對全自動電泳熒光免疫分析儀μTASWakoi30 進(jìn)行了精密度、線性范圍及準(zhǔn)確性等性能的驗(yàn)證分析.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣本 在專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)下選擇南充市中心醫(yī)院門診體檢患者的新鮮血清，要求標(biāo)本無溶血、無黃疸、無渾濁.

1.1.2 儀器和試劑 儀器：μTASWakoi30全自動電泳熒光免疫分析儀.試劑：甲胎蛋白及其異質(zhì)體比率測定試劑盒(批號TQ659)；異常凝血酶原測定試劑盒(批號TQ660)； 與試劑盒相應(yīng)的原裝配套質(zhì)控品校準(zhǔn)液、芯片盒、稀釋液、清洗液等.試劑均由日本和光純藥Wako提供，在有效日期內(nèi)使用，使用環(huán)境的濕度、相對濕度、供電電壓及接地狀況等符合要求.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控檢測 連續(xù)3天實(shí)驗(yàn)，每天實(shí)驗(yàn)前均按要求進(jìn)行質(zhì)控檢測.

1.2.2 精密度驗(yàn)證 分別取AFP-L3與PIVKA-Ⅱ高、中、低3個質(zhì)量濃度或者質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的血清標(biāo)本作為待測樣品，其中：血清標(biāo)本1 AFP 2 108.56 μg/L，AFP-L3 28.4%，PIVKA-Ⅱ 22 763.13 μg/L；血清標(biāo)本2 AFP 594.31 μg/L，AFP-L3 88.51%，PIVKA-Ⅱ 1 160.47 μg/L；血清標(biāo)本3 AFP 5.69 μg/L，AFP-L3 <0.5%,PIVKA-Ⅱ 12.07 μg/L.分裝-20 ℃保存，連續(xù)檢測3天，每天重復(fù)檢測5次，參照各自試劑說明書評價精密度.

1.2.3 線性驗(yàn)證 將AFP，AFP-L3，PIVKA-Ⅱ按盡可能接近廠商聲明的檢測限各取一高值血清樣本，以WAKO質(zhì)量濃度1 883.2 μg/L、羅氏濃度>1 210 μg/L為標(biāo)準(zhǔn)分別按1∶0，1∶1，1∶4，1∶19，1∶190，0∶1 共6種比例用稀釋液稀釋后重復(fù)檢測2次，求其實(shí)測均值，對照各自預(yù)測值參考CLSI的EP-6A2文件進(jìn)行線性評估.

1.2.4 準(zhǔn)確性驗(yàn)證 分2組每組準(zhǔn)備2份已知質(zhì)量濃度的不同血清樣本，按校準(zhǔn)品與血清體積比35 mL/120 mL，70 mL/120 mL分別加入AFP-L3校準(zhǔn)品(101 μg/L)及PIVKA-Ⅱ校準(zhǔn)品(409 AU/L)作為待測樣本，每份樣本重復(fù)檢測3次，取平均值，與理論值進(jìn)行比較，參考試劑說明書判斷其回收率是不在80%～120%區(qū)間.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析.

2 結(jié)果分析

2.1 質(zhì)控檢測

通過3天質(zhì)控檢測可知，質(zhì)控1的AFP分別為52.30，53.50，54.10 μg/L，AFP-L3相應(yīng)為27.60%，27.60%，27.70%；質(zhì)控2的AFP分別為210.40，218.40，219.50 μg/L，AFP-L3相應(yīng)為19.80%，19.80%，19.60%；質(zhì)控1的PIVKA-Ⅱ分別為104.00，108.00，110.00 AU/L；質(zhì)控2的PIVKA-Ⅱ分別為2 121，2 184，2 228 AU/L.其各項(xiàng)質(zhì)控對應(yīng)的實(shí)測均值X、標(biāo)準(zhǔn)差SD、精密度CV具體見表1.

表1 μTASWakoi30質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)比較

2.2 精密度驗(yàn)證

AFP，AFP-L3，PIVKA-Ⅱ高、中、低3個水平樣本連續(xù)3天的檢測結(jié)果列于表2.

表2 μTASWakoi30精密度數(shù)據(jù)分析

由表2可知，AFP 3個水平的精密度依次為2.47%，3.12%，4.84%，相應(yīng)AFP-L3精密度依次為1.37%，0.20%，0%，PIVKA-Ⅱ精密度依次為1.29%，4.08%，6.40%.

2.3 線性驗(yàn)證

各取一高值A(chǔ)FP,AFP-L3，PIVKA-Ⅱ血清樣本按稀釋比例1∶0，1∶1，1∶4，1∶19，1∶190，0∶1 共6種比例稀釋后進(jìn)行檢測，具體檢測結(jié)果見表3.

表3 μTASWakoi30線性值

結(jié)合預(yù)測值進(jìn)行線性擬合，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：AFP線性回歸方程為y=0.997 1x-5.018 4，R2=0.999 7；PIVKA-Ⅱ線性回歸方程分別為y=0.975 5x+843.4，R2=0.998.線性回歸方程如圖1～2所示.

圖1 AFP線性回歸分析Fig. 1 AFP Linear Regression Analysis

圖2 PIVKA-Ⅱ 線性關(guān)系分析Fig. 2 Analysis of PIVKA-Ⅱ Linear Relation

2.4 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

比較在不同血清樣本中AFP，AFP-L3，PIVKA-Ⅱ?qū)崪y均值與理論值，計(jì)算回收率， 結(jié)果見表4.

表4 μTASWakoi30準(zhǔn)確性驗(yàn)證數(shù)據(jù)

由表4可知，回收率均在試劑要求的80%～120%區(qū)間內(nèi)，在校準(zhǔn)品與血清體積比70 mL/120 mL下，最高回收率(AFP)為117.45%，最低回收率(AFP-L3)91.26%.

3 討論

近年來，甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3和異常凝血酶原PIVKA-Ⅱ作為新的HCC標(biāo)志物已得到廣泛應(yīng)用.國內(nèi)外多項(xiàng)研究均表明，聯(lián)合PIVKA-Ⅱ和AFP 檢測可提高肝癌診斷的敏感性[12-13]，PIVKA-Ⅱ?qū)υ\斷原發(fā)性肝癌有較高特異性，且血清中的PIVKA-Ⅱ水平與AFP水平無相關(guān)性，對AFP假陰性肝癌的診斷有一定的價值[14].秦燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AFP對小于3 cm的肝臟腫瘤具有最高的診斷價值，PIVKA-Ⅱ?qū)χ型砥诟伟┑脑\斷價值高于AFP.AFP和PIVKA-Ⅱ聯(lián)合 AFP-L3能明顯提高在肝硬化患者中篩選肝癌和小肝癌患者的能力.由此可見，AFP，AFP-L3及PIVKA-Ⅱ各有優(yōu)點(diǎn)，但目前該指標(biāo)的檢測我國尚未廣泛應(yīng)用于臨床.醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由日本和光純藥出品的全自動電泳熒光免疫分析儀μTASWakoi30實(shí)行AFP，AFP-L3與PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測，可以提高 HCC 患者早期診斷的靈敏度和特異度.筆者根據(jù)國家《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》和《臨床實(shí)驗(yàn)室對商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證(ws/t 420-2013)》的規(guī)定和要求[16]，對其主要性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果表明，AFP，AFP-L3及PIVKA-Ⅱ質(zhì)控實(shí)測值均在正常范圍，標(biāo)準(zhǔn)差最高為PIVKA-Ⅱ的53.78，最低為AFP-L3%的0.06，精密度CV均在10%以內(nèi)(最高為2.85%)，質(zhì)控效果良好；從AFP，AFP-L3及PIVKA-Ⅱ 3個不同水平血清標(biāo)本的實(shí)測均值和標(biāo)準(zhǔn)差來分析其精密度CV，均低于10%，其最高值為4.84%，滿足試劑說明書要求；通過高值A(chǔ)FP，AFP-L3及PIVKA-Ⅱ樣本在1∶0，1∶1，1∶4，1∶19，1∶190，0∶1共 6種不同稀釋比例條件下檢測，實(shí)測均值與理論值線性擬合良好，AFP線性回歸方程為y=0.997 1x-5.018 4，R2=0.999 7，PIVKA-Ⅱ線性回歸方程為y=0.975 5x+843.4，R2=0.998；在不同水平校準(zhǔn)品與血清體積比條件下，對實(shí)測均值與理論值進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)在35 mL/120 mL條件下最高回收率(AFP)117.45%，最低回收率(AFP-L3)91.68%，均在試劑說明的80%～120%正常范圍，表明檢測準(zhǔn)確性高.由此說明，通過μTASWakoi30電泳熒光分析儀既能解決篩查 HCC的AFP靈敏度和特異度問題[17]，又能豐富PIVKA-Ⅱ在肝癌早期診斷當(dāng)中的應(yīng)用.