張靜，李書(shū)琪，黃波，閔清華，姜鈺環(huán)，楊偉明，徐顏美，林晉，劉靜，王小中

(江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥是慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）治療失敗的主要原因之一，其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜。眾多研究報(bào)道，基因異常剪接是腫瘤出現(xiàn)化療抵抗的重要分子基礎(chǔ)[1-3]。Bcl-x基因是Bcl-2家族成員之一，其pre-mRNA通過(guò)選擇性剪接（alternative splicing）主要生成兩種剪接異構(gòu)體，Bcl-xL和Bcl-xS。Bcl-xL是重要的抗凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-xS則是重要的促凋亡蛋白，兩者生物功能相互拮抗，表達(dá)處于平衡狀態(tài)[4]。當(dāng)Bcl-x基因的剪接發(fā)生異常時(shí)，Bcl-xL/BclxS比值顯著升高，現(xiàn)已證實(shí)這是乳腺癌等[5，6]腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子事件。所謂vMO技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)、外直接調(diào)控靶基因選擇性剪接的高效方法，與培養(yǎng)的細(xì)胞共同孵育能高效轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，也可以經(jīng)靜脈、腹腔注射到體內(nèi)后能高效轉(zhuǎn)運(yùn)至全身各組織器官，與靶基因前mRNA的特定核苷酸序列結(jié)合，從而調(diào)控選擇性剪接。2016年Nature雜志報(bào)道應(yīng)用Vivo-Morpholinos（vMO）在小鼠體內(nèi)靶向調(diào)控內(nèi)含子剪接位點(diǎn)，為我們提供了成功調(diào)控選擇性剪接的例證[7]。目前，運(yùn)用vMO技術(shù)處理IM耐藥CML細(xì)胞后，觀察Bclx剪接異構(gòu)體變化的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究有望為臨床治療CML及其他伴Bcl-x剪接異常的腫瘤的化療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 IM耐藥CML細(xì)胞K562/G01（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所）。RMPI 1640培養(yǎng)基（Bioind）含10%FBS，青霉素和鏈霉素濃度均為100U/ml。Imatinib購(gòu)自Sigma Aldrich公司，PrimeScriptTM RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），Bcl－x抗體 （美國(guó)BD公司），β－actin抗體 （Proteintech中國(guó)分公司），vMO試劑盒（美國(guó)Gene Tools公司）

1.2 方法

1.2.1 vMO序列設(shè)計(jì)原理 我們檢索相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中調(diào)控Bcl－x基因外顯子2b剪接的機(jī)制均為剪接增強(qiáng)調(diào)控，在Bcl－x基因的外顯子2a、2b及內(nèi)含子2中均存在相應(yīng)的外顯子增強(qiáng)子，使外顯子2b的剪接得以增強(qiáng)，即促進(jìn)Bcl－xL的形成，減少Bcl－xS的形成。反義寡核苷酸能通過(guò)與pre－mRNA上5’或3’剪接位點(diǎn)靶向結(jié)合從而阻止剪接體對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別，進(jìn)而增加其他隱蔽剪接位點(diǎn)的使用，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的剪接調(diào)控。我們?cè)O(shè)計(jì)本項(xiàng)目的序列由Gene Tools公司合成。

1.2.2 總 RNA 提取及 Bcl－xL 和 Bcl－xS mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)Bcl－x、GAPDH基因設(shè)計(jì)特異引物，引物序列見(jiàn)表1。

按照以下PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 2×Taq PCR Master Mix 10μl， 上下游引物各 1μl，cDNA 2μl及dH2O 6μl，總反應(yīng)體積為20μl進(jìn)行加樣，點(diǎn)動(dòng)混勻，離心后放入PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 5min；（95℃ 30s； 退火溫度 （見(jiàn)表）35s；72℃ 30s）35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min；以 GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μl，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。利用BIO－RAO凝膠成像儀進(jìn)行圖像檢測(cè)，并用其分析軟件（Image Lab）進(jìn)行定量分析。

1.2.3 Western－Blot檢測(cè) Bcl－xL 和 Bcl－xS 蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞總蛋白提取和定量檢測(cè)合格后，經(jīng)SDS－PAGE電泳。孵育一抗：用一抗稀釋液對(duì)一抗體進(jìn)行稀釋 （Bcl－x 稀釋?zhuān)?：4000； 內(nèi)參稀釋?zhuān)?：1000），孵育二抗：用1×TBST或者封閉液稀釋二抗（anti－rabbit：1：10000）， 將 PVDF 膜完全浸沒(méi)于二抗液中，洗膜后暗室曝光拍照存圖，利用BIO－RAO凝膠成像儀進(jìn)行圖像檢測(cè)，并用其分析軟件（Image Lab）進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組采用方差分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K562/G01細(xì)胞對(duì)Imatinib化療耐受作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/G01細(xì)胞A、B、C，調(diào)整每孔細(xì)胞密度均（2～3）×105，依次向每孔加 2μM imatinib（根據(jù)天津血液研究所建議耐藥細(xì)胞穩(wěn)定生存用量）作用0，24h，48h，鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)幾乎無(wú)變化，提示K562/G01細(xì)胞對(duì)imatinib出現(xiàn)抵抗（圖1）。

圖 1 K562/G01細(xì)胞對(duì) imatinib抵抗 (A，B，C：K562/G01細(xì)胞2μM imatinib 作用 0，24，48h)

2.2 合成靶向Bcl－x剪接調(diào)控位點(diǎn)的特異性vMO我們?cè)O(shè)計(jì)的靶向調(diào)控Bcl－x選擇性剪接的vMO序列如下：5′－GCTTGGTTCTTACCCAGCCGCCGTT－3′（下劃線處為外顯子2b和內(nèi)含子2交界處），對(duì)應(yīng)Bcl－x 基因序列為：5′－CAGGAG[AACGGCGGCTGG gta aga acc aag c]cc ctt gtg tgt c－3′（大寫(xiě)字母表示外顯子序列，小寫(xiě)字母表示內(nèi)含子序列，中括號(hào)內(nèi)為互補(bǔ)結(jié)合區(qū)）。

2.3 vMO能穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞 如前文所述，我們初步設(shè)計(jì)合成了靶向調(diào)控Bcl－x選擇性剪接的vMO序列，將3′端以熒光素FAM標(biāo)記，于飽和濕度條件下37℃，5%CO2，10%小牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基與耐藥CML細(xì)胞株K562/G01共孵育 24h，48h，72h，96h，使用 imatinib 濃度1μM，取細(xì)胞以PBS洗至無(wú)游離熒光于倒置顯微鏡觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，得出陽(yáng)性百分率。結(jié)果顯示48h大量細(xì)胞發(fā)熒光（圖2.A），同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)vMO轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)77.74%（圖2.B），說(shuō)明vMO在48h后能成功高效的轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

圖2 倒置熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記vMO在48h轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞（A），流式細(xì)胞儀檢測(cè)48h胞內(nèi)熒光強(qiáng)度（B）

2.4 vMO有效調(diào)節(jié)Bcl-xL/Bcl-xS mRNA比值 按照上述條件同時(shí)提取4個(gè)不同處理組細(xì)胞的RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳，最終在紫外燈下觀察條帶結(jié)果。PCR瓊脂糖電泳條帶顯示：與單獨(dú)IM和單獨(dú)vMO組處理K562/G01細(xì)胞相比，IM+vMO組的Bcl-xL mRNA表達(dá)量顯著降低，同時(shí)Bcl-xS mRNA表達(dá)量明顯升高。Bcl-xL和Bcl-xS mRNA進(jìn)行灰度值半定量分析，則BclxL/Bcl-xS比值下降更明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 vMO處理前后細(xì)胞胞內(nèi)Bcl-xL和Bcl-xS mRNA比值的表達(dá)變化

2.5 vMO有效調(diào)節(jié)Bcl-xL/Bcl-xS蛋白比值 以相同的條件提取4個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總蛋白，按照上述相同條件提取4個(gè)不同處理組細(xì)胞的總蛋白，通過(guò)相關(guān)軟件分析，經(jīng)過(guò)蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、孵抗體和曝光后，最終得到蛋白條帶結(jié)果。Bcl-xL在vMO聯(lián)合IM處理之后表達(dá)量明顯降低，同時(shí)Bcl-xS表達(dá)量明顯升高。說(shuō)明，IM聯(lián)合vMO轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞影響B(tài)cl-xL/Bcl-xS比值。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖4 Western blot檢測(cè)不同處理組對(duì)Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表達(dá)的影響

人類(lèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-x會(huì)通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生Bcl-xL和Bcl-xS兩種異構(gòu)體，它們?cè)诰S持細(xì)胞生存上分別起抑制或促進(jìn)凋亡的作用。近年發(fā)現(xiàn)異常選擇性剪接在多種不同類(lèi)型白血病患者體內(nèi)普遍存在，與白血病的發(fā)生、發(fā)展及化療抵抗等密切相關(guān)[8]。研究報(bào)道，剪接體Bcl-xL在CML中高表達(dá)，其作用不是引發(fā)CML或維持CML狀態(tài)，而是促進(jìn)CML向加速期或急變期發(fā)展，并且可以提高CML細(xì)胞對(duì)TKIs等化療藥物的抗性[9]。另有研究證實(shí)，高濃度的Bcl-xL是維持CML干細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素之一，而CML干細(xì)胞的增殖、衍變則是CML進(jìn)展的根本和耐藥的源泉[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL在IM耐藥CML中高表達(dá)，而B(niǎo)cl-xS顯著低表達(dá)，提示Bcl-x基因異常選擇性剪接是導(dǎo)致CML進(jìn)展和化療抵抗的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。綜合分析其機(jī)制主要涉及兩個(gè)方面：一方面，Bcl-xL抗凋亡剪接體的過(guò)量表達(dá)能抑制化療藥物誘導(dǎo)的死亡受體和(或)線粒體凋亡通路的激活；另一方面，Bcl-xS促凋亡剪接體的表達(dá)水平和活性的降低，則能致正常濃度的化療藥物不能誘導(dǎo)凋亡信號(hào)的傳播[11，12]。

vMO技術(shù)是一種能體內(nèi)外直接調(diào)控靶基因選擇性剪接的新方法。本研究在對(duì)CML的研究基礎(chǔ)上，以耐藥CML（K562/G01）細(xì)胞為模型，利用特殊設(shè)計(jì)的vMO技術(shù)與K562/G01細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示單獨(dú)IM組和單獨(dú)vMO租對(duì)K562/G01細(xì)胞Bcl-x基因選擇性剪接模式的調(diào)控是有限的，產(chǎn)生此研究結(jié)果的可能原因是與耐藥細(xì)胞中存在維持Bcl-x發(fā)生異常剪接的機(jī)制有關(guān)。IM藥物作用的發(fā)揮在很大程度上是通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，而在藥物選擇壓力條件下，細(xì)胞可能通過(guò)抑制凋亡通路實(shí)現(xiàn)對(duì)IM耐受作用。因此，我們推測(cè)IM聯(lián)合vMO在K562/G01中能有效糾正Bcl-x基因的剪接模式，這一變化可能與兩者明顯協(xié)同作用有關(guān)，進(jìn)而激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)耐藥CML細(xì)胞凋亡，仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。其調(diào)控機(jī)制是：當(dāng)反義寡核苷酸靶向與Bcl-x基因外顯子2b和內(nèi)含子2交界處結(jié)合后，該5’剪接位點(diǎn)不能被剪接體識(shí)別，將迫使剪接體與外顯子2a處5’剪接位點(diǎn)結(jié)合，最終導(dǎo)致外顯子2b被切除，在減少Bcl-xL的生成的同時(shí)增加BclxS的生成，顯著降低Bcl-xL/Bcl-xS比值，實(shí)現(xiàn)雙向調(diào)控，這才是靶向Bcl-x基因治療的最優(yōu)策略。