路宏朝，李蕊清，孫志陽，王 令，張 濤

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

甲基轉(zhuǎn)移酶樣21C(Methyltransferase like 21C,METTL21C)是一種類甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于甲基轉(zhuǎn)移酶樣21 (Methyltransferase like 21，METTL21)亞家族中的一員，該亞家族共有4個 成員，包括METTL21A、METTL21B、METTL21C和METTL21D[1-4]。甲基轉(zhuǎn)移酶主要參與蛋白質(zhì)翻譯后的甲基化修飾過程，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步調(diào)控信號分子與目標(biāo)蛋白之間的相互作用，從而參與DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)相互作用和細(xì)胞增殖分化等重要生命過程[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，METTL21亞家族成員可通過與分子伴侶結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。其中，METTL21D與分子伴侶含纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein,VCP)結(jié)合，調(diào)節(jié)VCP的翻譯后修飾。當(dāng)METTL21D表達(dá)失調(diào)后，將導(dǎo)致神經(jīng)肌肉疾病發(fā)生[8]。METTL21C具有蛋白-賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在脊椎動物所有組織中均表達(dá)，尤其在骨骼肌中高表達(dá)[9]。Tizioto等[10]采用QTL(Quantitative trait loci)分析Nellore牛品質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，高品質(zhì)牛肉中METTL21C表達(dá)較高。Huang等[11]采用GWAS(Genome-wide association study)分析發(fā)現(xiàn)METTL21C基因突變與人類肌肉減少癥有關(guān)，進(jìn)一步在C2C12鼠成肌細(xì)胞中驗證其功能，發(fā)現(xiàn)METTL21C通過調(diào)節(jié)鈣濃度的平衡而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，抑制肌肉萎縮。由此可知，METTL21C可能參與哺乳動物骨骼肌生長發(fā)育過程。但關(guān)于雞源METTL21C基因研究鮮見報道。鑒于此，本試驗以略陽烏雞為材料，提取略陽烏雞腿肌組織總RNA，以反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，克隆METTL21C基因的CDS區(qū)序列，分析其生物信息學(xué)特征；將METTL21C片段克隆至pMD19-T載體，并插入真核超表達(dá)載體，分析其表達(dá)情況，為METTL21C基因后續(xù)的生物學(xué)功能研究提供技術(shù)支持，并為家雞骨骼肌生長發(fā)育機(jī)制研究提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 略陽烏雞受精蛋購自略陽縣同輝烏雞養(yǎng)殖場，于科裕全自動孵化機(jī)中孵化獲得初生6 d略陽烏雞。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix E×TaqTMⅡ試劑和ECL(Electro-Chemi-Luminescence)曝光液由TaKaRa公司提供；T4DNA連接酶購自New England Biolabs公司；含φ=10% FBS(Fetal bovine serum)的高糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)； FLAG抗體購自Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(HEART)；HRP標(biāo)記的二抗(康為世紀(jì)，1∶1 000)；GeneGnome XRQ化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Synoptics, USA)；倒置熒光相差顯微鏡(Leica，DFC450, USA)；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方 法

1.2.1METTL21C基因組織差異表達(dá) 分別取初生6 d的略陽烏雞胃、砂囊、肺臟、骨骼肌、肝臟、皮膚和心臟7種組織，采用Trizol法分別提取總RNA，核酸/蛋白測定儀測其濃度[12]。分別以不同組織總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，按照PrimeScript(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成相應(yīng)的cDNA。分別以7種組織的cDNA為模板，選取雞的β-actin作為內(nèi)參基因。采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測METTL21C基因的mRNA表達(dá)水平(引物序列見表1)。擴(kuò)增體系：SYBRⅡ (TaKaRa) 10 μL，Primer F/R 3.2 μL，cDNA2 μL，H2O 4.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。溶解曲線收集信號的程序：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s 。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的雞METTL21C基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計針對雞METTL21C基因的特異性引物，并分別在上下游引物中加BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點。引物序列為：上游引物CCGGAATTCCCCAACAAAATGCAAAG，下游引物CGCGGATCCAGTTCTCTCTTACCGTGGCTT，引物由北京奧科生物科技有限公司合成。

1.2.3 總RNA提取及cDNA的合成 采用Trizol法提取略陽烏雞腿肌組織總RNA，測定濃度[12]。以提取總RNA為模板，Oligo(dT)為引物, 采用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。

1.2.4METTL21C基因片段克隆 以略陽烏雞腿肌組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10× PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，cDNA模板 2 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 36 μL。PCR反應(yīng)程序為Touch Down。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取適量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并于凝膠成像系統(tǒng)中成像、分析。

采用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠，根據(jù)膠回收試劑盒回收基因片段。將目的片段與載體pMD19-T于16 ℃過夜連接。16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃ 培養(yǎng)。

1.2.5 菌落PCR檢測及測序 將“1.2.4”中感受態(tài)細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，從平板上挑取5個單菌落于20 μL滅菌的ddH2O中，震蕩充分混勻。取上述1 μL菌液進(jìn)行菌落PCR檢測，反應(yīng)體系(20 μL)：Mix 10 μL，模板1 μL，上下游引物各加1 μL，ddH2O 7 μL，反應(yīng)程序同“1.2.4”所述。PCR鑒定后，將含有目的片段的菌液送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORF Finder對METTL21C基因進(jìn)行開放讀碼框分析；利用NCBI BLAST 對METTL21C基因序列進(jìn)行同源性分析；采用Mega 5.0軟件構(gòu)建METTL21C系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。

1.2.7 真核超表達(dá)載體的構(gòu)建 從pMD19-T- METTL21C質(zhì)粒上采用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后回收METTL21C基因片段，同時用BamHI和EcoRI雙酶切帶有Flag標(biāo)簽的pCD513B空載體，進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取適量感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐的LB平板，于37 ℃培養(yǎng)。挑選單克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證。

1.2.8 重組質(zhì)粒表達(dá)分析 在已構(gòu)建的Flag-pCD513B-METTL21C重組載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，空載體pCD513B作為對照組。用opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，靜置5 min后，混合質(zhì)粒稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑，靜置20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，并通過Western Blot檢測其表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 略陽烏雞不同組織中 METTL21C基因的表達(dá)水平

選取雞的β-actin為內(nèi)參基因，采用qPCR技術(shù)檢測METTL21C在胃、砂囊、肺臟、骨骼肌、肝臟、皮膚和心臟7種組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，以胃組織中的表達(dá)水平為對照，METTL21C在心肌組織中表達(dá)量最高，其次是骨骼肌，皮膚中表達(dá)量略高于胃組織中，砂囊和肺組織中的表達(dá)量低于胃組織，但差異不顯著(圖1)。

*表示差異顯著(P<0.05) * mean significant difference(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01) ** mean exemely significant difference(P<0.01)

圖1雞METTL21C基因在7種組織中mRNA的表達(dá)
Fig.1mRNAexpressionlevelofMETTL21Cinseventissuesfromchicken

2.2 METTL21C基因片段克隆

以略陽烏雞腿肌組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠檢測，發(fā)現(xiàn)3號泳道出現(xiàn)與768 bp大小一致的條帶(圖2)?；厥誐ETTL21C片段與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化后，挑取5個單菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測，發(fā)現(xiàn) 3個陽性克隆(圖3)。挑選陽性克隆菌液經(jīng)通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序驗證，結(jié)果表明成功克隆獲得METTL21C基因的CDS區(qū)序列。

2.3 METTL21C基因CDS區(qū)核苷酸序列及編碼氨基酸序列分析

應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序分析METTL21C基因序列， 發(fā)現(xiàn)METTL21C基因CDS區(qū)全長序列為747 bp，軟件分析其堿基組成，A：31.3%，T：25.5%，G： 21.0%，C： 22.2%，共編碼249個氨基酸(圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DNA marker (DL2000) ; 1～3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR amplification product

圖2片段METTL21C的PCR擴(kuò)增
Fig.2PCRamplificationofMETTL21Cgene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DNA marker ( DL2000) ; +.陽性克隆 Positive clones；-.陰性克隆 Negative clones

圖3菌落PCR鑒定
Fig.3IdentificationofcolonyPCR

2.4 略陽烏雞 METTL21C基因進(jìn)化樹構(gòu)建

將獲得的略陽烏雞METTL21C基因序列與原雞及其他物種的METTL21C基因進(jìn)行比對分析，并以牛的基因序列為根，通過Mega 5.0軟件中的Neighbor-Joining Tree 法構(gòu)建略陽烏雞METTL21C基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。由圖5可知，在METTL21C基因位點，本研究所選擇的物種形成兩大支系包括中國家鵝、阿德里企鵝等，另一個支系以原雞為代表，略陽烏雞與原雞序列同源性最高，其次是鵪鶉、火雞和珍珠雞。

圖4 略陽烏雞 METTL21C基因CDS區(qū)序列及編碼蛋白序列Fig.4 CDS region sequence and deduced amino acid of METTL21C gene in Lueyang black-bone chicken

圖5 METTL21C進(jìn)化樹分析Fig.5 METTL21C evolutionary tree analysis

2.5 METTL21C真核超表達(dá)載體構(gòu)建

經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后回收METTL21C目的片段和帶有Flag標(biāo)簽的空載體，連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR鑒定和酶切驗證，發(fā)現(xiàn)4個單菌落均得到與METTL21C基因(768 bp)大小一致的片段(圖6)，選取其中一個陽性克隆擴(kuò)增抽提質(zhì)粒，進(jìn)一步用BamHI和EcoRI雙酶切進(jìn)行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， pCD513B- METTL21C重組質(zhì)粒被BamHI和EcoRI切開，所克隆的METTL21C基因成功插入pCD513B空載體(圖7)，說明pCD513B- METTL21C超表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DNA marker(DL2000); 1-4.4個單菌落PCR產(chǎn)物 PCR product four single colonies

圖6菌落PCR鑒定
Fig.6IdentificationofcolonyPCR

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DNA marker (DL2000) ；1.未切質(zhì)粒 Undigested plasmids；2.雙酶切產(chǎn)物 Enzyme-digested products

圖7pCD513B-METTL21C酶切驗證
Fig.7Enzyme-digestedproductsofplasmids

2.6 METTL21C超表達(dá)載體表達(dá)研究

將pCD513B- METTL21C含F(xiàn)lag標(biāo)簽的重組載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量綠色熒光，表明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中(圖8)；采用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后METTL21C蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)組在30 ku大小處出現(xiàn)蛋白條帶(圖9)，與目的蛋白大小一致。

A. 白光 White; b. 綠光 (200×) Green (200×)

圖8轉(zhuǎn)染METTL21C重組質(zhì)粒熒光觀察
Fig.8Fluorescenceobservationaftertransfecting

圖9 METTL21C蛋白表達(dá)水平Fig.9 Expression of METTL21C protein level

3 討 論

作為蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶，METTL21C可能通過甲基化修飾作用抑制或激活蛋白質(zhì)活性[14-15]。在肌肉生長發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)甲基化修飾效應(yīng)普遍存在。例如，內(nèi)源性甲基轉(zhuǎn)移酶G9(Aeuchromatic histonelysine N-methyltransferase 2, EHMT2)通過影響成肌分化決定因子(Myogenic differentiation antigen，MyoD)和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(Myocyte enhancer factor 2,MEF2，MEF2D)的甲基化水平而調(diào)控肌細(xì)胞分化[16-17]。而對于METTL21C基因的研究報道主要集中于人和小鼠，大部分文獻(xiàn)側(cè)重于蛋白結(jié)構(gòu)方面研究[18]，關(guān)于METTL21C在雞骨骼肌發(fā)育中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此，為進(jìn)一步闡明METTL21C基因在骨骼肌發(fā)育中的作用，本試驗利用qPCR技術(shù)檢測其在略陽烏雞各組織中的表達(dá)情況，獲得其組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示，METTL21C在略陽烏雞胃、砂囊、肺臟、骨骼肌、肝臟、皮膚和心臟7種組織中均有表達(dá)，其中心肌中表達(dá)量最高，其次是骨骼肌，與大部分文獻(xiàn)報道一致[9-10]。在肌肉組織中的高表達(dá)可能預(yù)示著METTL21C基因在肌肉生長發(fā)育過程發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，但關(guān)于該基因功能鑒定及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步試驗研究。

本研究采用基因克隆和核酸測序技術(shù)獲得雞METTL21C基因的CDS區(qū)核苷酸序列，分析發(fā)現(xiàn)其CDS區(qū)核苷酸序列長度為747 bp，共編碼249個氨基酸。氨基酸序列相似性比對分析發(fā)現(xiàn)，略陽烏雞METTL21C基因與原雞具有較高的同源性，同時通過構(gòu)建進(jìn)化樹也顯示出該基因序列在禽類動物中高度保守，說明METTL21C基因不能用于畜禽品種之間的分類鑒定，但是可用于鳥類及其他物種屬、種級的分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)合GeneBank數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)報道及本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL21C基因在不同物種均存在，且序列的相似度較高，說明該基因是一個較為古老的基因，對機(jī)體的生長發(fā)育具有重要意義。另外，本試驗構(gòu)建雞METTL21C基因超表達(dá)載體并在細(xì)胞水平成功表達(dá)，可為進(jìn)一步解析METTL21C基因在家雞骨骼肌生長發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。