王蘭英，韓丹丹，鄧 恒，駱焱平

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228)

自由基是引起生物細(xì)胞衰老的重要因素。過量的自由基可以給生物帶來脂質(zhì)過氧化、膜損傷、酶失活和DNA鏈的斷裂等危害?？寡趸镔|(zhì)可以通過消除自由基使得生物機(jī)體免受損傷，因此抗氧化研究是當(dāng)今生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。隨著海洋微生物活性的不斷挖掘，其抗氧化活性研究也逐漸引起科研人員的關(guān)注。如Sun等[2]從海洋中分離的絲狀真菌Keissleriellasp.YS4108具有明顯的清除超氧陰離子和羥基自由基的活性；閻雪芬等[3]采用化學(xué)發(fā)光法篩選獲得7株對活性氧具有抑制作用的深海真菌，其中有3株對羥基自由基和過氧化氫有較好的清除能力；Sun等[4]從一株海洋真菌的發(fā)酵液中分離的次生代謝產(chǎn)物顯示出良好的體外抗氧化活性，尤其是清除超氧陰離子自由基能力較為突出。可見，從海洋中分離具有抗氧化活性的微生物切實(shí)可行。海洋生物的共生微生物與寄主有密切的關(guān)系，共生微生物可分泌種類豐富、生物活性多樣的次生代謝產(chǎn)物[5]，如珊瑚共生的微生物菌株能夠產(chǎn)生酚酸類、生物堿、聚酮、黃酮、萜類等化合物，這些化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[6-7]。但是關(guān)于珊瑚共生抗氧化研究鮮有報道，因此開展珊瑚共生真菌抗氧化研究具有重要意義。

蜂巢珊瑚是指群體似蜂巢狀的塊狀珊瑚，其個體一般為對角形，個體之間由1～4個相通的壁孔連接，體壁薄，不甚發(fā)育[8]。蜂巢珊瑚是中國雷州半島徐聞西南海岸石珊瑚優(yōu)勢種之一[9]。該類珊瑚因孔率少，致密度高，適合作為人工骨的材料[10]。肖勝藍(lán)等[11]對蜂巢珊瑚附生真菌種類進(jìn)行調(diào)查，但關(guān)于該類珊瑚共生微生物抗氧化活性的研究未見報道。本研究從蜂巢珊瑚中分離共生真菌，篩選抗氧化活性較好的菌株，對其進(jìn)行鑒定，為尋找新型抗氧化類藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試珊瑚 蜂巢珊瑚樣品采自海南省西沙群島。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，海水1 L，瓊脂16 g。海水取自海口市白沙門附近海域。

1.1.3 主要試劑 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]，均為分析純。真菌基因組提取試劑盒購自索萊寶生物公司。引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 樣品處理及菌株分離

樣品處理：用滅菌海水清洗珊瑚表面3次，稱取2 g珊瑚樣品置于滅菌研缽內(nèi)研磨至泥漿狀，放入50 mL錐形瓶中，加入20 mL滅菌海水， 120 r/min振蕩30 min，靜置20 min，取其上清液1 mL加入9 mL滅菌海水依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5g/mL。每個質(zhì)量濃度梯度樣品取100 μL置于PDA培養(yǎng)基中，用滅菌涂布棒涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～10 d，待菌落長出，挑取菌落邊緣獲得純化菌株。純化菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存，待用[12]。

1.3 真菌發(fā)酵液的制備

將純化菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，待菌株長到培養(yǎng)皿面積的2/3時，平板中加入3 mL滅菌海水，用滅菌涂布棒刮取真菌孢子，收集孢子懸浮液用無菌紗布過濾除去菌絲，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板計數(shù)，然后用滅菌海水稀釋孢子懸浮液至107CFU/mL。配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝樣量為100 mL，120 ℃滅菌20 min，待培養(yǎng)液冷卻后接入上述孢子懸浮液1 mL，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，獲得菌株發(fā)酵液。將發(fā)酵液室溫下5 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測液，備用。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 高價鐵離子還原作用 將硫酸亞鐵FeSO4配制成不同濃度梯度的溶液，以亞鐵離子濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)(x)，以波長593 nm的吸光度作為縱坐標(biāo)(y)，繪制硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考Du等[13]的方法配制Ferric reducing ability of plasma(FRAP)溶液，取0.1 mL待測液與3.0 mL FRAP溶液混合，37 ℃恒溫水浴5 min，取出后迅速混勻，測量混合液在波長593 nm的吸光度，通過硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出混合液中硫酸亞鐵濃度，評價供試菌株對高價鐵離子還原能力。

1.4.2 DPPH自由基清除作用 參考Bouaziz 等[14]的方法并且稍作修改：用φ=95%乙醇配制2×104mol/L DPPH溶液，在離心管中加入0.5 mL提取液及3.5 mL DPPH溶液，常溫下孵育30 min，混勻后在波長517 nm測量吸光度，記為As；用φ=95%乙醇代替樣品測定吸光度，記為Ab。DPPH清除率計算公式如下：

DPPH清除率=(Ab-As)/Ab×100%

1.4.3 ABTS自由基清除作用 參考Thoo等[15]方法測定ABTS自由基清除率： 配制ABTS自由基溶液(取10 mL 7 mmoL/L ABTS溶液，加入10 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，混合后黑暗靜置16 h，用φ=95%乙醇將其稀釋至波長734 nm吸光度為0.7±0.02，黑暗密封，備用)，取0.1 mL待測提取液加入3.9 mL ABTS自由基溶液，反應(yīng)6 min混合均勻后在波長734 nm測量吸光度，記為As；用0.1 mLφ=95%乙醇代替樣品測吸光度，記為Ab。ABTS自由基清除率計算公式如下：

ABTS清除率=(Ab-As)/Ab×100%

1.5 S-1-5菌株的鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將供試菌株接種于PDA，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌落特征；采用插片法觀察菌絲及孢子形態(tài)[16]。

1.5.2 菌株生長速率測定 將供試菌株接種至PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h采用十字交叉法測量菌落直徑，連續(xù)測量5 d，計算菌落平均生長速率。

1.5.3 真菌的分子生物學(xué)鑒定 將菌株S-1-5接種至PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，無菌條件下刮取菌絲置于滅菌研缽，加液氮研磨至粉末狀。按照真菌基因組DNA提取試劑盒(D2300，索萊寶科技有限公司，中國)中說明書進(jìn)行菌絲基因組提取，以提取的基因組 DNA 為模板，采用真菌 ITS rDNA 基因通用引物 ITS1/ITS4 擴(kuò)增，引物序列為：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[17]。對核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為50 μL：雙蒸水33 μL，PCR Buffer ( 含 Mg2+) 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，10 μmol/L的引物 ITS1 與 ITS4 各 1 μL，DNA 模板 5 μL，DNATaqpolymerase (10 U) 1 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃，3 min；進(jìn)入循環(huán)： 94 ℃，45 s； 57 ℃，45 s； 72 ℃，75 s，35個循環(huán)；72 ℃，10 min。取 5 μL PCR 產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用goldview(10 000×，索萊寶科技有限公司，中國)染色，凝膠成像儀(GelDocXR，BIO-RAD，美國)檢測。PCR 產(chǎn)物的序列測定由上海生工有限公司完成。

對菌株S-1-5的 ITS rDNA 基因序列，利用NCBI中BLAST進(jìn)行同源性比對，選出與該序列相似性較高的核酸序列。使用Mega(ver.6.0)軟件，采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析(Bootstrap) 進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次[18]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計軟件 SPSS (ver.22.0)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性測定

2.1.1 高價鐵離子還原能力 測得FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.063x+0.020 3，R2為0.998 4，方程相關(guān)性好，可信度高。測定各菌株發(fā)酵液對高價鐵還原能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測試的9株真菌的總體高價鐵還原能力較強(qiáng)(圖1)，經(jīng)菌株發(fā)酵液處理后，混合液中Fe2+濃度均在70 mol/L以上，尤其菌株S-1-5對高價鐵離子還原能力最強(qiáng)，經(jīng)其發(fā)酵液處理后混合液中Fe2+濃度可達(dá)132.016 mol/L。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05)，下同 Different lowercase lettters mean significant difference(P<0.05)，the same below

圖1菌株的高價鐵離子還原作用
Fig.1Ferric-reducingantioxidantpowerofisolates

2.1.2 DPPH清除率測定 二苯基苦味肼基自由基DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在波長517 nm有最大吸收。不同菌株發(fā)酵液對DPPH清除能力的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株發(fā)酵液，均有一定的抗氧化作用(圖 2)，其中菌株S-1-5對DPPH的清除能力最強(qiáng)，清除率為70.60%，與其他菌株相比顯著差異；其次菌株S-1-2 對DPPH也有較好的清除能力，清除率為52.32%，其余真菌發(fā)酵液對DPPH清除率均低于30%。

2.1.3 ABTS清除率 ABTS自由基清除率廣泛應(yīng)用于體外抗氧化活性測定，在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)過氧化后可以生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色的ABTS自由基，溶液發(fā)生褪色、特征吸光值降低。不同菌株發(fā)酵液對ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株對ABTS自由基均有一定的清除能力(圖3)，其中菌株S-1-5對ABTS的清除能力最強(qiáng)，清除率為67.18%，與其他菌株相比顯著差異；其次菌株S-1-6、S-1-8和S-1-3對ABTS也有較好的清除能力，清除率>50%；相比較之下菌株S-1-1、S-1-2、S-1-4、S-1-7和S-1-9清除能力稍差，清除率<50%。

圖2 菌株的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of isolates

圖3 菌株的ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging capacity of isolates

2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對菌株S-1-5培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落形態(tài)不規(guī)則；菌絲短小而致密，初期菌落黃綠色，菌落邊緣淡黃色，后期菌落顏色加深為土黃色，菌落邊緣墨綠色(圖4-A)，菌落背后有黑色皺褶(圖4-B)。該菌株分生孢子呈橢圓形(圖4-C)，分生孢子梗具多隔膜，呈竹節(jié)狀(圖4-D)，菌絲分支少(圖4-F，4-G)。菌株S-1-5平均生長速率為0.56 cm/d。該菌落特征與分生孢子形態(tài)與Zalar等[19]報道的枝孢屬球孢枝孢Cladosporiumsphaerospermum基本一致。

A.菌株S-1-5培養(yǎng)菌落正面 The surface of colonies of isolate S-1-5 on PDA medium；B.菌株S-1-5培養(yǎng)菌落背面 The backside of colonies of isolate S-1-5 on PDA medium；C.分生孢子 Conidia；D.分生孢子梗放大 Enlargement of conidiophores；E.菌絲及分生孢子梗 Mycelia and conidiophores；F.菌絲放大 Mycelial morphology；G.菌絲形態(tài) Enlargement。標(biāo)尺為30 μm Bar=30 μm

圖4菌株S-1-5的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)學(xué)觀察
Fig.4MorphologicalobservationsofcoloniesandconidiaofisolateS-1-5

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株S-1-5的ITS r DNA序列長度為525 bp，將此序列提交GenBank注冊，獲得登錄號為MG787259。運(yùn)用NCBI database中在線Blast比對發(fā)現(xiàn)，菌株S-1-5與枝孢屬(Cladosporium)種類的序列同源性較高。利用 MEGA(Ver.6.05)軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，菌株S-1-5與球孢枝孢(C.sphaerospermum，GenBank accession No:MF061765)的進(jìn)化距離最近。結(jié)合該菌株菌落特征及分生孢子形態(tài)特征，將菌株S-1-5 鑒定為枝孢屬球孢枝孢(C.sphaerospermum)。

圖5 基于ITS rDNA序列同源性構(gòu)建的菌株S-1-5 18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of isolate S-1-5 based on 18S rDNA sequence homology

3 討 論

共生微生物是指微生物附著在其他生物上，與被附生生物協(xié)同生存的一類微生物。許多研究指出，這類微生物對于被附生生物的生存起著極為重要的作用，如海綿共生微生物可為海綿形成一種化學(xué)防御屏障抵御有害附著物、病原微生物危害[20]；珊瑚共生微生物可參與珊瑚生物合成，防御外來生物的入侵以及增強(qiáng)珊瑚的抗逆性[21-22]。本研究從蜂巢珊瑚中分離獲得的一株共生真菌S-1-5具有較強(qiáng)地消除自由基的能力。過量的自由基可以給生物帶來脂質(zhì)過氧化、膜損傷、酶失活和DNA鏈的斷裂等危害。因此，通過清除自由基以保護(hù)被附生生物機(jī)體免受損傷可能是附生微生物防御外來生物入侵的重要機(jī)制之一。肖勝藍(lán)等[11]對徐聞珊瑚保護(hù)區(qū)的8種珊瑚進(jìn)行共生真菌的調(diào)查指出，蜂巢珊瑚附生真菌的優(yōu)勢屬為枝孢屬。本研究對分離于蜂巢珊瑚的菌株S-1-5鑒定為枝孢霉屬球孢枝孢?？梢姡闟-1-5可能是蜂巢珊瑚生存過程中重要的枝孢屬種類。

海洋共生真菌的活性次生代謝產(chǎn)物的研究已有報道。人們普遍認(rèn)為，海洋共生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎、活性高等特點(diǎn)[23-26]。因此，對海洋共生微生物的深入研究可為解決海洋產(chǎn)物含量低及藥源不足等問題帶來希望，是開發(fā)海洋新型藥物和尋找海洋動植物替代資源的重要途徑[27]。陳艷麗[28]從直針尖柳珊瑚共生真菌(Penicilliumcommune)發(fā)酵液中獲得一種具有抗氧化活性的物質(zhì)，經(jīng)鑒定該物質(zhì)為胞外多糖類，該結(jié)構(gòu)的多糖首次從珊瑚中獲得，具有開發(fā)為海洋糖類藥物的潛在價值。本研究發(fā)現(xiàn)分離自蜂巢珊瑚的菌株S-1-5發(fā)酵液具有很強(qiáng)的抗氧化活性，但未對其活性物質(zhì)進(jìn)一步分離。鑒于珊瑚共生真菌潛在的生防價值，在后續(xù)研究中有必要對菌株S-1-5活性成分進(jìn)行分離、鑒定，為開發(fā)海洋微生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。