尚立娜，安利峰，張城，龔川友，周彰映，田世馨，李曉琴，趙晉*

（1 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2 甘肅省腫瘤醫(yī)院病理科， 蘭州 730030）

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤的第四位。在宮頸癌的組織學(xué)類型中最常見的為鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC），占所有病例的85%～90%。研究發(fā)現(xiàn)，高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）癌基因E6、E7 的持續(xù)表達(dá)是宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及持續(xù)進(jìn)展為浸潤(rùn)性宮頸癌的必要條件[1]，其中E7 可以通過(guò)從E2F 復(fù)合物中螯合Rb 來(lái)阻止、破壞一系列信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，侵襲或轉(zhuǎn)移[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的暫時(shí)性和可逆性的生物學(xué)過(guò)程，具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞發(fā)生成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)改變，細(xì)胞粘附降低，細(xì)胞活力、運(yùn)動(dòng)性增加[3]。研究表明，EMT 在促進(jìn)原發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用[4]，上皮細(xì)胞的侵襲性取決于EMT 的激活。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages, TAMs）是泛指在腫瘤發(fā)生過(guò)程中浸潤(rùn)于腫瘤并影響其發(fā)展轉(zhuǎn)歸的巨噬細(xì)胞，具有M2 型巨噬細(xì)胞的表型并表達(dá)CD68 和CD163[5]。研究發(fā)現(xiàn)，高密度的TAMs 與預(yù)后不良相關(guān)，并影響各種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[6,7]。但是在宮頸癌變中HPV16E7 的表達(dá)與EMT 及TAMs之間到底有什么樣的聯(lián)系，還未見報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（CINII-III）、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（CINI）及慢性宮頸炎中HPV16E7 蛋白的表達(dá)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記E-cadherin、N-cadherin 的表達(dá)以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD163 的表達(dá)情況，來(lái)探討不同HPV16E7 的表達(dá)狀態(tài)下，EMT 與TAMs 之間的關(guān)系。

資料與方法

1 標(biāo)本來(lái)源

收集甘肅省腫瘤醫(yī)院病理科2014 ～2018 年石蠟包埋標(biāo)本共233 例。其中，宮頸鱗狀細(xì)胞癌98 例，包括角化型鱗狀細(xì)胞癌51 例，非角化型鱗狀細(xì)胞癌47 例，患者年齡25～67 歲，中位年齡48 歲；CINIIIII 52 例；CINI 54 例；另外選取因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為慢性宮頸炎的宮頸標(biāo)本29 例。以上病例的收集排除宮頸癌根治性手術(shù)前后接受過(guò)放射治療與化療等非手術(shù)治療的患者。所有患者知情同意， 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑及方法

所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定，石蠟包埋，4μm厚切片，常規(guī)HE 及免疫組織化學(xué)染色，MaxVision法詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。鼠抗人單克隆抗體CD68（MAB-0041，1∶100）， 鼠抗人單克隆抗體CD163（MAB-0206，1∶100）， 鼠抗人單克隆抗體E-cadherin（MAB-0589，1∶100），鼠抗人單克隆抗體N-cadherin（MAB-0571，即用型）及免疫組織化學(xué)MAXVisionTM2試劑盒（KIT-5920）購(gòu)自福州邁新公司，HPV16E7 鼠抗人單克隆抗體（289-17013，1∶1000）購(gòu)自GeneTex 公司。

3 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片后做出判斷。HPV16E7 以細(xì)胞核呈黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，E-cadherin 以細(xì)胞膜、N-cadherin 以細(xì)胞質(zhì)呈黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取5 個(gè)視野的算術(shù)平均值。①根據(jù)顯色細(xì)胞的比例計(jì)分：0 分（顯色癌細(xì)胞為0%）；1 分（顯色細(xì)胞＜10%）；2 分（顯色細(xì)胞10%～25%）；3 分（顯色細(xì)胞25%～50%）；4 分（顯色細(xì)胞＞50%）。②根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：0 分（癌細(xì)胞無(wú)顯色）；1 分（淺黃色)；2 分（棕黃色或黃褐色)。兩種計(jì)分方法相乘，作為最終免疫組化判定結(jié)果。其中，E-cadherin 及N-cadherin 的染色結(jié)果判斷：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽(yáng)性（+），3～5 分為中等陽(yáng)性（++），6～8 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），1～8 分計(jì)為表達(dá)陽(yáng)性，0 分計(jì)為表達(dá)陰性；HPV16E7 的染色結(jié)果判斷：0～1 分計(jì)為表達(dá)陰性，2～8 分計(jì)為表達(dá)陽(yáng)性。TAMs 的分布和計(jì)數(shù)： 用 CD163 標(biāo)記TAMs。以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)被染為棕黃色的細(xì)胞為CD163+巨噬細(xì)胞，在光鏡下觀察其一般形態(tài)及分布后，對(duì)CD163+巨噬細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，首先在10 倍物鏡下找到視野中CD163+巨噬細(xì)胞在腫瘤中密度最高的五個(gè)區(qū)域，即熱點(diǎn)區(qū)域，然后在400 倍物鏡下對(duì)CD163+巨噬細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS18. 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用ˉχ±s表示，各分類變量的相關(guān)關(guān)系均采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，組內(nèi)及組間頻率比較采用秩和檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0. 05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HPV16E7 在慢性宮頸炎、CINI、CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增強(qiáng)

HPV16E7蛋白的表達(dá)主要定位在細(xì)胞核，本研究結(jié)果顯示，HPV16E7蛋白在慢性宮頸炎、CINI、CINIICINIII 及宮頸癌中表達(dá)率逐漸升高（圖1，表1）。

表1 E-cadherin 和N-cadherin 在宮頸癌變中表達(dá)水平比較Tab. 1 Comparison for expression levels of E-cadherin and N-cadherin in the cervical neoplasma generation

2 E-cadherin 在慢性宮頸炎、CINI、CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及與HPV16E7 的關(guān)系

E-cadherin 的表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜。在慢性宮頸炎、CINI、CINII-CINIII 及宮頸癌中E-cadherin表達(dá)逐漸降低（r=-0.154，P=0.018）（圖1）。HPV16E7 陽(yáng)性的CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中E-cadherin 的表達(dá)明顯低于HPV16E7 陰性標(biāo)本（P=0.047，P=0.002），而CINI 及慢性宮頸炎組差異沒有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

3 N-cadherin 在慢性宮頸炎、CINI、CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及與HPV16E7 的關(guān)系

N-cadherin 的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)，且更傾向于分布在癌巢的最外圍，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形(圖1)。在慢性宮頸炎、CINI、CINII-CINIII 及宮頸癌中N-cadherin 隨著宮頸癌變的進(jìn)展表達(dá)逐漸升高（r=0.362，P=0.000）；宮頸鱗狀細(xì)胞癌組內(nèi)比較顯示，HPV16E7陽(yáng)性者N-cadherin 表達(dá)明顯高于HPV16E7 陰性者（P=0.014）（表1）。

圖1 宮頸癌變中HPV16E7、E-cadherin、N-cadherin 表達(dá)及CD163+巨噬細(xì)胞分布的MaxVision 法免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，慢性宮頸炎中HPV16E7 蛋白呈陰性表達(dá)；E、I、M、Q，HPV16E7 蛋白在宮頸癌前病變及鱗狀細(xì)胞癌中呈陽(yáng)性表達(dá)；B、F、J、N、R，隨著宮頸癌變的發(fā)生E-cadherin 的表達(dá)逐漸降低；C、G、K，N-cadherin 在宮頸癌前病變中呈陰性表達(dá)；O，在宮頸癌中，N-cadherin 表達(dá)趨向于分布在癌巢邊緣的癌細(xì)胞，S, 上述宮頸癌中N-cadherin 陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)常呈長(zhǎng)梭形；D、H、L、P、T，隨宮頸癌變的發(fā)生CD163+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多。SCC：鱗狀細(xì)胞癌；CINII-III：高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；CINI：低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。比例尺，100μmFig.1 Immunohistochemical examination (MaxVision method) for expression of HPV16E7, E-cadherin and N-cadherin and distribution of CD163+macrophages in the cervical neoplasma generation. A, negative expression of HPV16E7 protein in chronic cervicitis; E, I, M, Q, positive expression of HPV16E7 protein in cervical precancerous lesions and squamous cell carcinom; B, F, J, N, R∶ the expression of E-cadherin was significantly reduced with the cervical neoplasma generation; C, G, K, negative expression of N-cadherin in cervical precancerous lesions ; O, in cervical cancer, N-cadherin expression tended to be distributed in peripheral cells of the cancer nest; S, the morphology of N-cadherin-positive cells often exhibited a long spindle shape; D, H, L, P, T, CD163+ macrophages increased gradually with the cervical neoplasma generation; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, highgrade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; scale bar, 100μm

4 CD163+巨噬細(xì)胞在慢性宮頸炎、CINI、CINIIIII 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的浸潤(rùn)情況及與HPV16E7的關(guān)系

CD163 主要定位在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，且更傾向于分布在癌巢浸潤(rùn)前沿的周圍間質(zhì)中。CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著宮頸癌變的發(fā)生逐漸升高（r=0.837，P=0.000）（圖1）。在CINI、CINII-II、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組內(nèi)，HPV16E7 陽(yáng)性組細(xì)胞數(shù)量明顯高于HPV16E7 陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021，P=0.000，P=0.000）（圖2A）。

5 宮頸癌的癌變過(guò)程中不同HPV16E7 的表達(dá)情況下CD163+巨噬細(xì)胞的數(shù)目與E-cadherin 表達(dá)的關(guān)系

圖2 不同宮頸病變組織中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量及其在不同HPV16E7 表達(dá)狀態(tài)下與E-cadherin 及N-cadherin 免疫反應(yīng)性之間的關(guān)系。A，不同宮頸病變組織中CD163+巨噬細(xì)胞的計(jì)數(shù)情況；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；SCC，鱗狀細(xì)胞癌；CINII-III，上皮內(nèi)高級(jí)別瘤變；CINI，上皮內(nèi)低級(jí)別瘤變；NC，不考慮HPV16E7 的表達(dá)情況；B，宮頸癌變過(guò)程中，無(wú)論HPV16E7 的表達(dá)如何，CD163+巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)與E-cadherin 的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；C，鱗狀細(xì)胞癌中，HPV16E7+組CD163+巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)與E-cadherin 的表達(dá)呈正相關(guān)，而HPV16E7-組則無(wú)相關(guān)關(guān)系Fig. 2 The number of CD163+ macrophages in different cervical lesions and their relationship with immunoreactivity of E-cadherin and N-cadherin under different HPV16E7 expression status. A, number of CD163+ macrophages in different cervical lesions; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, high-grade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; NC, HPV16E7 expression was not considered;B, during cervical carcinogenesis, CD163+ macrophages had a negative correlaton with expression of E-cadherin regardless of HPV16E7 status; C, in squamous cell carcinoma, the number of CD163+ macrophages in HPV16E7+ group was positively correlated with the expression of E-cadherin, but not correlated in HPV16E7- group

在慢性宮頸炎、CINI、CINII-III、宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，隨著CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目的增多，E-cadherin的表達(dá)逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.274，P=0.000）。HPV16E7 陽(yáng)性組與HPV16E7 陰性組中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與E-cadherin 亦呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.180，P=0.045；r=-0.192，P=0.046）（圖2B，表2）。

表2 宮頸癌變過(guò)程中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與E-cadherin 的相關(guān)關(guān)系Tab. 2 Correlation between the number of CD163+ macrophages and E-cadherin during cervical carcinogenesis

6 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中不同HPV16E7 表達(dá)情況下CD163+巨噬細(xì)胞的數(shù)目與N-cadherin 表達(dá)的關(guān)系

宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，隨著CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目的增多，N-cadherin 的表達(dá)逐漸增加（r=0.531，P=0.000）。HPV16E7 陽(yáng)性組中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與N-cadherin 的表達(dá)仍然呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.587，P=0.000），而HPV16E7 陰性組二者無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系（r=0.252，P=0.122）（圖2C，表3）。

表3 鱗狀細(xì)胞癌中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與N-cadherin 的相關(guān)關(guān)系Tab. 3 Correlation between the number of CD163+ macrophages and N-cadherin in squamous cell carcinoma

討 論

腫瘤EMT 表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞上皮特征的喪失如上皮細(xì)胞表型E-cadherin、β-cadherin 表達(dá)的減少以及間質(zhì)細(xì)胞表型如N-cadherin、vimentin 表達(dá)的增加，在宮頸癌中亦存在這種現(xiàn)象[8]。許多研究者將EMT 過(guò)程中E-cadherin 的喪失和N-cadherin 表達(dá)的增加稱為“cadherin switch”，而“cadherin switch”被認(rèn)為是EMT 的主要標(biāo)志[9,10]。然而，Abdallah 等[11]最近通過(guò)對(duì)前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin和N-cadherin之間沒有負(fù)相關(guān)，推測(cè)“cadherin switch”不是EMT發(fā)展的必要步驟。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin 的表達(dá)隨著宮頸癌變的進(jìn)展表達(dá)逐漸降低，而N-cadherin的表達(dá)隨著宮頸癌變的進(jìn)展表達(dá)逐漸升高，這一結(jié)果符合“cadherin switch”的特征，提示“cadherin switch”可能在宮頸癌的癌變過(guò)程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)HPV16 癌基因及E6/E7 蛋白與宮頸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的EMT 相關(guān)[12,13]，HPV16E7 可以和LSD1 形成復(fù)合物來(lái)促進(jìn)EMT 的發(fā)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌兩組組內(nèi)比較中，HPV16E7 陽(yáng)性者其E-cadherin 的表達(dá)低于HPV16E7陰性患者。在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，HPV16E7 陽(yáng)性組的N-cadherin 表達(dá)明顯高于HPV16E7 陰性組，這提示在宮頸癌中，HPV16E7 蛋白的表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)“cadherin switch”來(lái)促進(jìn)EMT，癌前病變中HPV16E7 蛋白也參與EMT 的發(fā)生。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在宮頸中，隨著癌變程度升高TAMs 數(shù)量隨之升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在慢性宮頸炎、CINI、CINII-III 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，這與Hammes LS等[15]的研究結(jié)果相符。Swangphon P等[16]發(fā)現(xiàn)TAMs的浸潤(rùn)與高危HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)之間明顯相關(guān)，并與宮頸病變嚴(yán)重程度相對(duì)應(yīng)。Chen XJ 等[17]亦有類似報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在CINI、CINIIIII 及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組內(nèi)比較中，HPV16E7 陽(yáng)性患者其CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯高于HPV16E7 陰性患者，由此提示HPV16E7 的表達(dá)可能促進(jìn)了TAMs的浸潤(rùn)，與前述結(jié)果相符合。

研究發(fā)現(xiàn)，癌癥募集和激活TAM 的能力在很大程度上取決于惡性細(xì)胞獲得未分化的間充質(zhì)表型的能力，而獲得未分化間充質(zhì)表型也是EMT 的一部分[18,19]。在膽管細(xì)胞癌[20]、三陰性乳腺癌[21]、肺癌[22]、口腔癌[23]、結(jié)腸癌[24,25]、肝細(xì)胞癌[26]中，TAMs 可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生來(lái)促進(jìn)腫瘤的侵襲、進(jìn)展或轉(zhuǎn)移。在宮頸癌變過(guò)程中情況又如何呢？本研究結(jié)果顯示，宮頸癌變過(guò)程中，隨著CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目的增多，E-cadherin 的表達(dá)逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，隨著CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目的增多，N-cadherin 的表達(dá)逐漸增加，二者呈正相關(guān)關(guān)系。從這些結(jié)果我們初步推測(cè)TAMs 可能通過(guò)調(diào)節(jié)“cadherin switch”誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。那么，HPV16E7 的表達(dá)是否影響了此過(guò)程呢？我們的研究結(jié)果顯示不管HPV16E7 陽(yáng)性或是陰性，CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與E-cadherin 表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，HPV16E7陽(yáng)性組中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)目與N-cadherin 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，而HPV16E7陰性組二者無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系，提示HPV16E7 的表達(dá)可能并非是影響CD163+巨噬細(xì)胞相關(guān)的E-cadherin表達(dá)降低的直接因素。但HPV16E7 的表達(dá)可能參與了CD163+巨噬細(xì)胞相關(guān)的N-cadherin 表達(dá)增高的過(guò)程。所以我們推測(cè)，HPV16E7 蛋白促進(jìn)EMT中N-cadherin 蛋白表達(dá)增加可能是通過(guò)誘導(dǎo)TAMs的浸潤(rùn)來(lái)完成的，而HPV16E7 蛋白促進(jìn)EMT 中E-cadherin 蛋白表達(dá)的降低，其機(jī)制并沒有TAMs 的參與，具體途徑還有待進(jìn)一步研究。