王騫，譚林，陳維順

（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院消化內(nèi)科，株洲 412000）

目前中國每年胃癌發(fā)病率及死亡率分別居于第2、3 位[1]，然而我國胃癌的早期診斷率不足10%，通過探索各類細胞信號通路研究胃癌的發(fā)病機制及尋找可靠的胃癌相關分子標志物是當前研究的熱點。Wnt/β-catenin 與NF-κB 通路是兩條在進化中高度保守的信號通路，兩條信號通路之間可通過獨立及互相串聯(lián)來調(diào)節(jié)細胞存亡、增殖及分化等。Wnt/β-catenin 與NF-κB 的異常活化均與胃癌的發(fā)生有關[2,3]。特異性頂部盤狀底板反應蛋白家族（Rspos）是新近發(fā)現(xiàn)的Wnt 信號通路激活劑，其家族成員Rspo1 與富含亮氨酸的重復G 蛋白偶聯(lián)受體5（LGR5）結合后可激活Wnt/β-catenin通路[4]，已有研究發(fā)現(xiàn)Rspos-LGR5-Wnt/β-catenin 這一信號傳導途徑對正常胃上皮細胞的增殖更新以及促進細胞癌變及腫瘤侵襲、轉移等方面有著重要作用[5-7]。核轉錄因子κB（NFκB）是一種核轉錄調(diào)節(jié)因子，以p65/p50 二聚體為中心的經(jīng)典NF-κB 通路的異?；罨纱龠M腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移[8]。近來研究[9]發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin與NF-κB 通路之間存在多種互相調(diào)控而活化的機制，從而形成復雜的共刺激信號網(wǎng)絡。本研究通過檢測Rspo1、LGR5 與NF-κB/p65 在胃癌組織中的表達，分析三者與胃癌臨床病理及患者預后之間的關系，并初步探討Rspo1-LGR5 這一新Wnt 激活途徑與經(jīng)典NF-κB 通路之間的可能相關性。

材料與方法

1 標本收集

收集中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院2014年8月至2016年5月普外科胃癌根治手術切除標本115例，癌旁正常胃組織標本20 例（均距癌緣＞10cm，病理證實無癌浸潤）?；颊咝g前均未接受放、化療，所有標本均經(jīng)術后病理證實。其中男性82 例，女性33 例，年齡35～89 歲（平均年齡61 歲）。胃癌組織根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第7 版標準進行臨床TMN 分期，浸潤深度按照UICC 標準中的T 分期標準確定，依據(jù)病理標準確認分化程度。所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，制成4μm 厚連續(xù)切片。

2 試劑

兔抗人Rspo1 多克隆抗體（稀釋比1∶400）、兔抗人LGR5 多克隆抗體（稀釋比1∶100）、兔抗人NFκB/p65 多克隆抗體（稀釋比1∶800）購自英國Abcam公司。二甲苯、無水酒精、石蠟、PBS 緩沖液、枸櫞酸鈉緩沖液購自廣州瑞斯生物技術有限公司。SP試劑盒、DAB 顯色劑、中性樹膠封片劑購自北京中山金橋生物技術有限公司。

3 免疫組化染色及結果判斷

常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸高壓修復，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗，孵育過夜。DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。結果判斷：由病理科醫(yī)師雙盲閱片，以胞質(zhì)/胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學染色陽性。免疫組化計分包括染色強度及陽性細胞比例確定。按染色強度分級：無染色或與背景一致的淺黃色為0 分，黃色記1分，棕黃色記2 分，黃褐色記3 分。按陽性細胞比例分級：每片隨機觀察5 個高倍鏡視野（200×），計算染色陽性細胞所占比例：陽性細胞數(shù)＜5%計0分，5%～25%計1 分，26%～50%計2 分，＞50%計3 分。每張切片得分由染色強度評分與陽性細胞比例評分相加所得，0～3 分判定為陰性表達，4～6 分判定為陽性表達。

4 隨訪

通過電話及門診對患者進行隨訪，所有患者均隨訪至2019 年5 月或至患者死亡，共獲得隨訪資料115 例，失訪0 例。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析。率的比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關性分析；生存分析采用Kaplan-Meier 法，Log-Rank檢驗；單因素和多因素COX回歸比例模型分析胃癌患者的預后影響因素。取α=0.05 為檢驗水準，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌組織表達率增高

Rspo1、NF-κB/p65 主要表達于胞質(zhì)和胞核，LGR5 主要表達于胞質(zhì)，部分表達于胞核。在20 例癌旁正常組織中Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 陽性表達率分別為25%、35%、35%（圖1）；在115 例胃癌組織中Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 陽性表達率分別為54.8%、62.6%、60%（圖1），顯著高于正常組織（表1）。Rspo1 與LGR5 在胃癌組織中的表達位置基本一致（圖2）。

圖1 Rspo1、LGR5 和NF-κB/p65 在胃癌組織及正常組織中表達的免疫組織化學檢測。比例尺，50μmFig. 1 Immunohistochemical examination for expressions of Rspo1, LGR and NF-κB/p65 in the gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues.Scale bar, 50μm

表1 Rspo1、LGR5 和NF-κB/p65 在胃癌組織及正常組織中的表達Tab. 1 Expressions of Rspo1, LGR5 and NF-κB/p65 in gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues

2 Rspo1、LGR5 表達與臨床病理參數(shù)的關系

在胃癌患者中，Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 的表達與TNM 分期、浸潤深度、淋巴結及遠處轉移有關，另外，Rspo1 與腫瘤大小，LGR5 與腫瘤大小及分化程度同樣有關；Rspo1 的表達與患者性別、年齡、腫瘤分化程度，LGR5 的表達與患者性別、年齡，以及NF-κB/p65 的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度之間無明顯相關性（表2）。

3 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌組織中表達的相關性分析

LGR5 在Rspo1 陽性組中的表達率為77.8%（49/63），在Rspo1 陰性組中的表達率為44.2%（23/52），顯著低于Rspo1 陽性組（χ2=13.695，P＜0.001）；NF-κB/p65 在Rspo1 陽性組中的表達率為74.6%（47/63），在Rspo1 陰性組中的表達率為42.3%（22/52），顯著低于Rspo1 陽性組（χ2=12.380，P＜0.001）；NF-κB/p65 在LGR5 陽性組中的表達率為65.3%（47/72），在LGR5 陰性組中的表達率為51.2%（22/43），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.235，P=0.135）。

根據(jù)Spearman相關性分析，在胃癌組織中，Rspo1 與LGR5 的表達存在正相關，Rspo1 與NFκB/p65 的表達存在正相關，LGR5 與NF-κB/p65 的表達無明顯相關性（表3）。

4 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 表達與胃癌患者3 年生存率的關系分析

Kaplan-Meier 分析顯示，在胃癌患者中，Rspo1表達陽性組3 年生存率低于表達陰性組（χ2=10.656，P=0.001，圖3A）；LGR5 表達陽性組3 年生存率低于表達陰性組（χ2=12.439，P＜0.001，圖3B）；NF-κB/p65 表達陽性組3 年生存率低于表達陰性組（χ2=6.430，P=0.011，圖3C）。

5 胃癌患者預后Cox 回歸分析

單因素Cox 回歸分析顯示，腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、Rspo1、LGR5 及NF-κB/p65 表達陽性可能是影響胃癌患者預后的危險因素；多因素Cox 分析顯示，淋巴結轉移、遠處轉移、Rspo1 表達陽性及LGR5 表達陽性可能是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（表4）。

圖2 Rspo1 與LGR5 在胃癌組織中表達部位比較。A，Rspo1; B，LGR5; scale bar, 50μm；比例尺，50μmFig. 2 Comparison for expression sites of Rspo1 and LGR5 in gastric carcinoma tissues. A, Rspo1; B, LGR5; scale bar, 50μm

討 論

Rspos 蛋白家族是一組由4 種典型的人類分泌型蛋白（Rspo1-4）組成的新型分泌型蛋白家族，參與體內(nèi)外Wnt/β-catenin 信號通路的放大[10]，其主要生理功能包括參與性別決定，調(diào)節(jié)肢體、內(nèi)臟器官發(fā)生、發(fā)育[11]。LGR5 是Rspos 的受體及Wnt/β-catenin通路的靶基因之一，是胃腸道、乳腺、卵巢等多種細胞的干細胞標志物[12]，也是胃癌、結直腸癌、肝癌等惡性腫瘤的干細胞標志物[13-16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[4]，LGR5 與Rspo1 結合后消除Wnt 拮抗劑ZNRF3/RNF43 的泛素化作用而激活Wnt/β-catenin 通路。Zhang 等[6]發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞系中Rspo2 與LGR5的表達均明顯高于正常細胞，Rspo2還與胃癌細胞的上皮間充質(zhì)轉化（EMT）有關。Shamai 等[7]則發(fā)現(xiàn)胃癌細胞可誘導間充質(zhì)干細胞表達Rspos 及LGR5以維持腫瘤細胞的增殖、生長。本研究發(fā)現(xiàn)Rspo1及LGR5 在胃癌中的表達高于癌旁正常組織，其表達水平與腫瘤大小、浸潤深度、TNM 分期、淋巴結及遠處轉移密切相關，并且免疫組化染色顯示二者在胃癌組織的表達位置基本一致，相關性分析也證實Rspo1 表達與LGR5 表達之間存在正相關，提示二者具有協(xié)同作用，并且其促癌作用是很可能是通過Rspo1-Wnt/β-catenin-LGR5 這一信號通路實現(xiàn)的。而生存分析顯示Rspo1 陽性表達及LGR5 陽性表達患者3 年生存率均低于表達陰性患者，同時Cox 回歸分析也顯示Rspo1 與LGR5 表達陽性是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。我們推測Rspo1 與LGR5通過活化經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路而導致了胃癌的侵襲、轉移及不良預后。

表2 . Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌中表達與臨床病理參數(shù)的關系Tab. 2 Relationship between the expressions of Rspo1, LGR5, NF-κB/p65 and the clinicopathological factors of gastric carcinoma

表3 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌組織中表達的Spearman 相關性分析Tab. 3 Spearman correlation analysis for the expressions of Rspo1, LGR5, NF-κB/p65 in gastric carcinoma

NF-κB 是調(diào)節(jié)免疫、炎癥等反應的重要轉錄因子，NF-κB/p65 是經(jīng)典NF-κB 通路的中心成員，而經(jīng)典NF-κB 的異?；罨驯话l(fā)現(xiàn)在胃癌的發(fā)生及侵襲、轉移中起到了重要作用[3,17]。大量研究證實NFκB與Wnt/β-catenin通路之間存在多種不同方式的互相影響共同促進惡性腫瘤的發(fā)生[9]。Schwitalla 等[18]研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin 與NF-κB/p65 通路相互活化促進胃腸道細胞向腺瘤及腺癌轉化。有研究[19]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染可激活巨噬細胞誘導產(chǎn)生TNF-α，并通過NF-κB 通路增強胃癌細胞中Wnt/β-catenin 信號傳導而加強其侵襲性。在乳腺癌、肺癌、結直腸癌[20-22]等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了Wnt/β-catenin 與NFκB通路之間的相互作用及共激活而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的現(xiàn)象。本次研究發(fā)現(xiàn)NF-κB/p65 在胃癌組織中高表達，TNM 分期晚，浸潤深，有淋巴結與遠處轉移的病例，NF-κB/p65 表達陽性率更高，與相關報道一致[23]，提示NF-κB 通路的活化在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。相關性分析表明，NF-κB/p65在Rspo1 陽性組中表達率高于Rspo1 陰性組的表達率，NF-κB/p65 的表達還與Rspo1 表達呈顯著正相關，提示Rspo1 在激活經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路同時還可能激活了NF-κB 通路，這兩條信號通路共同影響腫瘤細胞的增殖、侵襲過程。

綜上所述，本研究中我們發(fā)現(xiàn)Rspo1、LGR5 及NF-κB/p65在胃癌組織中高表達，表達水平與胃癌的發(fā)展程度相關，提示三者與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移有關。Rspo1 與LGR5 與患者預后有關，二者可能是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，檢測Rspo1、LGR5 的表達可能成為未來協(xié)助診斷、判斷預后的潛在分子標志物，也可能成為靶向治療胃癌的新靶點。而在相關性分析中發(fā)現(xiàn)NF-κB/p65 在Rspo1 陽性組的表達明顯高于Rspo1 陰性組，并且NF-κB/p65的表達與Rspo1 明顯正相關，提示Rspo1-LGR5 這一新Wnt 激活通路同時還活化了NF-κB 通路，進一步完善了Wnt/β-catenin 與NF-κB 通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡，同時為以后的相關研究提供了新的思路。然而由于本研究僅為臨床研究，Rspo1-LGR5 在胃癌中調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路的具體機制以及Rspo1- Wnt/βcatenin-LGR5 與NF-κB 通路的具體聯(lián)系與調(diào)控機理并不清楚，后續(xù)還需通過體外細胞和動物體內(nèi)研究等多個層面深入闡述其調(diào)節(jié)機制，并為進一步的胃癌診斷和治療提供理論依據(jù)。

表4 胃癌患者預后與病理因素的Cox 回歸分析Tab. 4 Cox regression analysis of prognosis and clinicopathological factors in gastric carcinoma patients