何萬領， 李曉麗， 楊龍幫， 李 冬

(河南科技大學動物科技學院， 河南 洛陽 471023)

砷(Arsenic,As)是廣泛存在于自然界的一種金屬元素，其毒性及其在環(huán)境中的行為與重金屬相似，進入環(huán)境的砷具有難降解、形態(tài)多變和遷移特性[1]。環(huán)境中的砷主要有兩個來源：一方面是自然因素，主要由成土母質(zhì)分解而來，不同成土母質(zhì)導致的土壤砷含量不盡相同[2]，我國土壤砷背景值為11.2 mg·kg-1[3]；另一方面是人為因素，其中采礦、冶煉、化工、化肥應用等是主要來源[4-5]，但自上世紀90年代至今，有機砷制劑在畜牧業(yè)中的廣泛應用成為新的砷污染源[6]。研究證實，有機砷制劑主要在動物腸道內(nèi)發(fā)揮作用，隨后絕大部分以有機砷原形排出體外[7]。與工礦業(yè)污染不同，畜禽糞肥返田的傳統(tǒng)利用方式使得養(yǎng)殖排泄砷可直接進入農(nóng)田土壤，污染范圍更廣，與人類生活更為密切。王付民等[8]對15個豬場周圍長期施用含砷豬糞的土壤及其作物砷污染研究表明，施用豬糞的土壤中砷含量均不同程度超過我國自然界最高砷背景值(15 mg·kg-1)，并使農(nóng)作物中砷含量超過國家標準的10～40倍。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是反芻動物優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料資源，也是非反芻動物優(yōu)質(zhì)的青綠飼料和蛋白質(zhì)補充飼料[9]，再加上紫花苜蓿適應性強、產(chǎn)量高，一直以來在我國有較大面積的種植。尤其是近些年，隨著國家糧改飼種植模式的推廣，紫花苜蓿種植面積陡增，采用動物糞肥作為有機肥較為普遍，受砷、銅等重金屬污染的可能性較大[10]。盡管有研究報道，紫花苜蓿對某些重金屬具有較強的耐受性，并可能用作重金屬污染修復的材料[11]。但從少量關(guān)于砷毒性的研究報道來看，砷對紫花苜蓿生長發(fā)育及生物量生產(chǎn)均是不利的[12-13]。

膨潤土是以蒙脫石為主要成分的層狀鋁硅酸鹽礦物，具有儲量豐富、價格低廉、對環(huán)境無污染等優(yōu)點。研究表明，膨潤土比表面大(通常為30～100 m2·g-1)，因而具有較高的表面能、較大的吸附能力[14-15]。此外，膨潤土還具有良好的吸收膨脹性和較大的陽離子交換容量(Cation exchange capacity,CEC，一般為0.8～1.2 mol·kg-1)，被認為是理想的重金屬污染修復材料[16]。目前，膨潤土在水體、底泥和土壤中鎘、鉛、鋅、銅、鉻等重金屬污染修復方面已展現(xiàn)出較大潛力[17-19]。但膨潤土在土壤砷污染修復方面的研究尚未見報道。

因此，本試驗通過模擬典型有機砷阿散酸暴露試驗，研究其對紫花苜蓿種子萌發(fā)和砷積累的影響，并通過添加鈉基和鈣基膨潤土，研究其對典型有機砷污染的修復作用，為土壤砷污染修復治理及牧草安全生產(chǎn)提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿(勁能5010，加拿大碧青公司)種子由華豐草業(yè)提供。

鈉基膨潤土(蒙脫石含量≥80%、密度2～3 g·cm-3、表觀粘度30～75 mPa.s)和鈣基膨潤土(蒙脫石含量≥60%、密度1.1～1.2 g·cm-3、表觀粘度≥30 mPa.s)均由山東圣源冶鑄材料有限公司提供。

阿散酸為飼料級，純度為35%，購自河南省鄭州桑園獸醫(yī)市場。

供試土樣采自河南科技大學試驗牧場(34°6′30′′ N，120°0′10″ E)表層土，土壤類型為褐土，具體理化性質(zhì)為pH7.52、有機質(zhì)(Organic matter,OM)21.58 g·kg-1,CEC 16.73 cmol·kg-1,N 1.09 g·kg-1,P 1.35 g·kg-1,K 24.35 g·kg-1。

1.2 試驗方法

1.2.1污染土壤制備 土樣經(jīng)剔除石子、樹葉、草根、蟲卵等雜質(zhì)后，用木槌將土塊敲碎，自然晾干，過2 mm篩。準確稱取一定量阿散酸，用55～60℃溶解，并均勻噴灑于土樣中，制成阿散酸含量分別為75 mg·kg-1和150 mg·kg-1的試驗土樣。以不加阿散酸的土樣為對照土樣。

1.2.2膨潤土的鈍化處理 將試驗用膨潤土置于65℃恒溫干燥箱內(nèi)烘至恒重，冷卻后，按照重量比0.5%，1.0%，3.0%的比例，分別稱取鈉基膨潤土或鈣基膨潤土與上述土樣均勻混合。按照每個培養(yǎng)皿60 g，準確稱取土樣，并平鋪于培養(yǎng)皿中，靜置鈍化3 d，從而制成種子發(fā)芽床。具體試驗設計見表1。

1.2.3發(fā)芽試驗 挑選顆粒飽滿、均勻的苜蓿種子置于質(zhì)量分數(shù)4%的KMnO4內(nèi)消毒10 min，用自來水流水清洗，再用去離子水沖洗3次后，用濾紙吸干種子表面水分。每個培養(yǎng)皿中均勻放入30粒處理后的種子，每個處理3個重復，每日按照稱量法加去離子水至恒重。種子培養(yǎng)于室溫環(huán)境中。

表1 試驗處理Table 1 Test treatments

注：砷水平為實測值

Note:The arsenic contents were experimentally measured

1.3 種子發(fā)芽指標測定

發(fā)芽試驗期間，每隔24 h記錄種子的發(fā)芽數(shù)，第15 d統(tǒng)計發(fā)芽率，并計算發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽結(jié)束后，每皿取10株，測量根長和芽長。

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/試驗種子粒數(shù)× 100%；

發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt) (Gt為t時間的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù))；

活力指數(shù)(Vigor index,VI)=GI×S(GI為發(fā)芽指數(shù)，S為一定時期內(nèi)的幼苗長度)。

1.4 砷含量測定

分別準確稱取土樣、根樣各0.1000 g，地上部植株樣品0.2000 g于三角瓶中，加入20 mL濃硝酸、2.5 mL濃硫酸和1.25 mL高氯酸，加蓋放置過夜。次日置電熱板上160～170℃消解，至冒白煙時取出冷卻，再加入5 mL去離子水蒸發(fā)至冒白煙，將余酸趕盡即可，冷卻。用去離子水將消化液洗入50 mL容量瓶中，加10 mL 5%(W/V)硫脲+抗壞血酸混合液，以5%(V/V)HCl定容。用雙道原子熒光光度計(AFS-9130，北京吉天儀器有限公司，中國北京)測定消煮液中As含量。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel2007整理數(shù)據(jù)，用SPSS13.0中的ONE-WAYANOVA模塊進行統(tǒng)計分析，均值多重比較采用Duncans方法進行，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨潤土對有機砷暴露下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

由表2可知，有機砷污染降低了紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。與空白組相比，75 mg·kg-1有機砷組紫花苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著降低(P<0.05)，150 mg·kg-1有機砷組發(fā)芽率顯著低于對照組(P<0.05)，且隨著有機砷污染水平增加，紫花苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。在有機砷暴露的土壤中加入鈉基膨潤土能夠降低砷毒性，與75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有機砷暴露組相比，添加0.5%，1.0%，3.0%的鈉基膨潤土組紫花苜蓿種子發(fā)芽率分別提高了11.8%，15.42%，13.71%和39.23%，45.33%，48.33%(P<0.05)；與75 mg·kg-1有機砷組相比，添加1.0%和3.0%鈉基膨潤土組發(fā)芽指數(shù)顯著升高(P<0.05)，與150 mg·kg-1有機砷組相比，添加0.5%，1.0%和3.0%鈉基膨潤土顯著升高紫花苜蓿種子發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)，1.0%和3.0%鈉基膨潤土顯著增加種子活力指數(shù)(P<0.05)。

表2 典型有機砷暴露下鈉基膨潤土對紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 2 Effects of Na-bentonite on seed germination percentage,germination index and vigor index of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

注：同列數(shù)據(jù)肩標字母不同者，表示差異顯著(P<0.05)，下表同

Note:Different letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

表3為典型有機砷暴露下鈉基膨潤土對紫花苜蓿根長和芽長的影響，結(jié)果可知，與對照組相比，有機砷暴露顯著降低紫花苜蓿根長和芽長(P<0.05)，且隨著有機砷暴露水平增加，呈顯著降低趨勢(P<0.05)。與有機砷暴露組相比，添加鈉基膨潤土顯著提高了紫花苜蓿根長和芽長(P<0.05)，且隨著鈉基膨潤土添加水平的增加而呈線性增加趨勢。與對照組相比，75 mg·kg-1有機砷暴露下，膨潤土各處理水平組紫花苜蓿根長和芽長均無顯著差異，而150 mg·kg-1有機砷暴露下，各膨潤土組顯著降低(P<0.05)。表明，隨著有機砷暴露水平增加，鈉基膨潤土的鈍化效果降低。

表3 典型有機砷暴露下鈉基膨潤土對紫花苜蓿根長和芽長的影響Table 3 Effects of Na-bentonite on root length and shoot length of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

由表4可知，有機砷暴露可顯著降低紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，添加鈣基膨潤土能夠降低有機砷暴露對紫花苜蓿種子萌發(fā)的不利影響。與75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有機砷組相比，添加0.5%，1.0%和3.0%鈣基膨潤土組紫花苜蓿種子發(fā)芽率分別提高了9.45%，9.81%，12.65%和21.09%，39.25%，42.26%；與150 mg·kg-1有機砷組相比，添加1.0%和3.0%鈣基膨潤土組種子發(fā)芽指數(shù)顯著升高(P<0.05)，3.0%鈣基膨潤土組種子活力指數(shù)顯著升高(P<0.05)。

表4 典型有機砷暴露下鈣基膨潤土對紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 4 Effects of Ca-bentonite on seed germination percentage,germination index and vigor index of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

由表5可知，與對照組相比，75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有機砷暴露組均顯著降低紫花苜蓿根長和芽長(P<0.05)，且隨著有機砷暴露水平增加，紫花苜蓿芽長呈顯著降低趨勢(P<0.05)。與砷暴露組相比，添加鈣基膨潤土各組紫花苜蓿根長和芽長顯著增加(P<0.05)，并呈現(xiàn)不同程度的劑量效應。

表5 典型有機砷暴露下鈣基膨潤土對紫花苜蓿根長和芽長的影響Table 5 Effects of Ca-bentonite on root length and shoot length of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

2.2 膨潤土對有機砷暴露下紫花苜蓿砷積累的影響

由圖1可知，有機砷暴露顯著增加了紫花苜蓿根和地上部砷的積累，且隨著有機砷暴露水平增加而增加(P<0.05)。鈍化劑膨潤土的加入能夠降低砷向紫花苜蓿的遷移，與有機砷暴露組相比，鈉基膨潤土各組紫花苜蓿根部和地上部砷含量顯著下降(P<0.05)；在相同有機砷暴露水平下，紫花苜蓿根部和地上部砷含量均是隨著鈉基膨潤土添加水平增加而降低；無論是低有機砷或高有機砷暴露組，在鈉基膨潤土添加水平為1%時對砷有較好的鈍化效果，隨著繼續(xù)增加鈉基膨潤土水平，砷遷移變化不大。

圖1 鈉基膨潤土對有機砷脅迫紫花苜蓿根和地上 部砷積累的影響Fig.1 Effect of Na-bentonite on arsenic accumulation in roots and shoots of Alfalfa exposed to organic arsenic注：同色柱子上標字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，下同Note：Different letters within the same color column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

由圖2可知，添加鈣基膨潤土可顯著降低砷向紫花苜蓿根和地上部的遷移(P<0.05)。與有機砷暴露組相比，0.5%,1.0%和3.0%鈣基膨潤土組紫花苜蓿根和地上部砷含量均顯著降低(P<0.05)，且隨著鈣基膨潤土添加水平增加，根和地上部砷含量呈下降趨勢，其中，1.0%和3.0%鈣基膨潤土組根中砷含量顯著低于0.5%水平組(P<0.05)，但各膨潤土處理組地上部砷含量無顯著差異。

圖2 鈣基膨潤土對有機砷脅迫紫花苜蓿根和地上 部砷積累的影響Fig.2 Effect of Ca-bentonite on arsenic accumulation in roots and shoots of Alfalfa exposed to organic arsenic

表6為兩種膨潤土對有機砷暴露的鈍化修復效應比較，結(jié)果可知，在有機砷暴露下，鈉基膨潤土對紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長和芽長的促進作用均不同程度優(yōu)于鈣基膨潤土，兩者間無顯著性差異。根部和地上部砷積累量分析可知，鈉基膨潤土較鈣基膨潤土不同程度降低了砷向紫花苜蓿的遷移，兩者差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 有機砷暴露對紫花苜蓿種子萌發(fā)和砷積累的影響

種子萌發(fā)狀況可直接影響幼苗的生長及后期生物量，研究重金屬對種子萌發(fā)的影響具有重要意義。目前，砷對種子萌發(fā)的影響多集中在水稻、小麥、大豆等農(nóng)作物[20-21]，而對紫花苜蓿等牧草種子萌發(fā)的影響研究較少，尤其是關(guān)于有機砷污染研究尚未見報道。本試驗通過模擬畜禽養(yǎng)殖過程中主要砷源阿散酸污染表明，當阿散酸污染水平在75 mg·kg-1或150 mg·kg-1時均可顯著降低紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，對紫花苜蓿根長和芽長均有顯著抑制作用。一般認為，重金屬對植物種子萌發(fā)和幼苗生長存在一個低濃度的刺激效應和高濃度抑制效應，類金屬砷也具有相似作用特點[22]。馬瓊芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在砷濃度為0～5 mg·kg-1范圍內(nèi)，砷對紫花苜蓿種子萌發(fā)具有促進作用，當砷濃度超過5 mg·kg-1，種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著降低，砷濃度40 mg·kg-1時發(fā)芽率顯著降低。與無機砷不同，一般認為有機砷并無毒性，對生物體不會產(chǎn)生毒害作用[23]。但進入土壤環(huán)境的有機砷可轉(zhuǎn)化為毒性更強的無機砷形態(tài)，從而滯留在土壤中對植物產(chǎn)生毒害[24-25]。研究表明[26]，當土壤阿散酸水平為75 mg·kg-1時，48 h內(nèi)其降解率可達42.99%，10 d后阿散酸僅剩4.36%。有機砷的降解與起初的暴露水平有關(guān)，一般來說，暴露水平越高降解越慢，但一旦開始降解環(huán)境中無機砷水平往往很快達到較高水平[27]。就本試驗而言，很顯然，在紫花苜蓿種子萌發(fā)的生理期內(nèi)，兩個阿散酸暴露濃度均使土壤中砷含量達到了抑制水平。從紫花苜蓿砷含量分析也可以看出，與空白土壤相比，有機砷暴露組紫花苜蓿根部和地上部砷含量顯著升高，且隨著有機砷暴露水平的增加呈顯著增加趨勢。這表明，暴露在土壤中的有機砷已進行了大量分解，從而以無機砷的形態(tài)向植物體遷移。

3.2 膨潤土對有機砷污染的修復與鈍化效應

施入鈍化劑是降低土壤重金屬污染生物可給性的重要措施之一，尤其適合于治理大面積中輕度土壤重金屬污染[28]。作為無機鈍化劑的一種，膨潤土單晶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易受自然環(huán)境變化而發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)改變或解離[29]，此外，膨潤土具有較大的陽離子交換量、比表面積和較低的滲透性能，是國際上常用的污染物工程屏障材料[30]。本試驗研究表明，在典型有機砷暴露下添加膨潤土能顯著提高紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，促進根部和地上部的生長。在低水平有機砷(75 mg·kg-1)污染下，鈉基膨潤土添加水平以1.0%時，紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高。高水平有機砷(150 mg·kg-1)污染下，需增加鈉基膨潤土添加才能降低砷的危害，以3.0%添加水平較好；在兩個污染水平(75 mg·kg-1和150 mg·kg-1)下，鈣基膨潤土均表現(xiàn)出隨著添加水平的增加而鈍化效果呈增加趨勢，表現(xiàn)為3.0%添加水平組紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長和芽長均不同程度優(yōu)于0.5%和1.0%添加水平。這一結(jié)果可能與兩種膨潤土中蒙脫石含量有關(guān)。研究表明，蒙脫石是膨潤土中主要的活性成分，其吸附與解吸附主要發(fā)生在蒙脫石上，蒙脫石含量對膨潤土吸附性能有顯著影響[31-32]。因此，就本試驗來說，所用鈉基膨潤土蒙脫石含量≥80%，鈣基膨潤土≥60%，因此，在相同膨潤土添加水平下，鈣基膨潤土中蒙脫石含量較低，增加添加量一定程度上提高了蒙脫石含量，從而促進了對砷的吸附鈍化作用。但從紫花苜蓿根部和地上部砷積累來看，在相同有機砷暴露水平下，兩種膨潤土均是在1.0%添加水平達到了積累穩(wěn)定性，隨著繼續(xù)增加膨潤土添加量，砷積累量并未顯著降低。以上結(jié)果表明，蒙脫石含量可能是影響兩種膨潤土對砷鈍化的關(guān)鍵因素，同時，兩種膨潤土在吸附鈍化砷的機制上也可能存在差異。此外，就本試驗的實地觀察來看，3.0%及以上膨潤土添加水平可造成土壤粘結(jié)性不同程度增加，從而可能影響種子的萌發(fā)。因此，在選用膨潤土作為土壤重金屬污染的修復劑時應注意添加水平。

總之，從本試驗的結(jié)果來看，在有機砷或砷暴露的土壤中添加無機鈍化劑膨潤土能夠降低砷對植物的毒害作用，減少砷向植物體的遷移，并以1.0%添加水平較好。但膨潤土對砷或有機砷的吸附鈍化確切機制尚不清楚，有待進一步研究。