呂孟雨 董福雙 柴建芳 周碩 張俊敏 王海波

摘要：以鄭58玉米自交系的種子作為試驗(yàn)材料，將玉米種子消毒，發(fā)芽后按長度分別將大、小2種玉米芽的生長點(diǎn)進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，經(jīng)過共培養(yǎng)后，通過對轉(zhuǎn)化后的再發(fā)芽情況和轉(zhuǎn)化芽的綠色熒光蛋白檢測，分析玉米芽的大小對轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，玉米種子芽長度在0.3～0.5 cm時(shí)用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，有利于農(nóng)桿菌對玉米芽生長點(diǎn)的侵染轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后芽的再生。

關(guān)鍵詞：玉米;芽長;農(nóng)桿菌;轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：S513? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）20-0168-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.040? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of maize seed bud size on Agrobacterium transformation

LYU Meng-yu，DONG Fu-shuang，CHAI Jian-fang，ZHOU Shuo，ZHANG Jun-min，WANG Hai-bo

（Institute of Genetics and Physiology/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province，

Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，China）

Abstract： The seeds of Zheng 58 maize inbred lines were used as experimental materials. After the corn seeds were sterilized and germinated， the growth points of big and small maize buds were transformed with Agrobacterium. After co-cultivation， the germination was carried out after transformation. By the situation and the results of green fluorescent protein detection of transformed buds， the effect of the size of maize buds on transformation was analyzed， and the size of maize buds suitable for Agrobacterium transformation was determined. The results showed that the maize seed buds were used for Agrobacterium transformation when they were 0.3～0.5 cm in length， which was beneficial to Agrobacterium tumefaciens infection and transformation of maize buds and post-transformation bud regeneration.

Key words： maize; bud length; Agrobacterium; transgenic

玉米是全球分布最廣的糧食作物，也是中國重要的作物[1，2]，轉(zhuǎn)基因玉米作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化重大成果已在世界各地普遍應(yīng)用，在中國的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用也將是大勢所趨，科研工作者應(yīng)在技術(shù)上和管理上都及早準(zhǔn)備[3]，深入研究玉米的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。玉米莖尖是近幾年遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的一種受體材料，與幼胚及其胚性愈傷組織等受體材料相比，該方法具有簡單易行、轉(zhuǎn)化周期短、轉(zhuǎn)化效率高、取材不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)[4]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前普遍采用的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，具有成本低、外源基因拷貝數(shù)低、外源基因能穩(wěn)定遺傳表達(dá)等特點(diǎn)，更適用于規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系[1]。1991年Gould等[5]用農(nóng)桿菌侵染玉米芽尖，得到轉(zhuǎn)基因植株，為建立玉米高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。人們對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行了多種形式的改進(jìn)[6-10]，但是利用玉米芽生長點(diǎn)作為受體材料，不經(jīng)過組織培養(yǎng)直接發(fā)育成轉(zhuǎn)化植株，可以減少玉米基因型對轉(zhuǎn)化的影響，是許多方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。由于玉米芽的大小對莖尖分生組織的分化程度有直接影響，可以影響農(nóng)桿菌對玉米芽生長點(diǎn)的轉(zhuǎn)化，王楠等[2]利用4～6 cm的玉米芽進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。但用于玉米芽生長點(diǎn)轉(zhuǎn)化的最佳芽大小尚需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)通過研究玉米芽大小對轉(zhuǎn)化效果的影響，確定農(nóng)桿菌對玉米芽生長點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的適宜玉米芽大小，有利于提高農(nóng)桿菌對玉米芽生長點(diǎn)的轉(zhuǎn)化效率。

1? 材料與方法

1.1? 材料

受體材料：利用玉米自交系鄭58的成熟種子，以玉米種子發(fā)芽后剝出的芽生長點(diǎn)作為轉(zhuǎn)化受體。

所用載體PEGAD（ubi+EGFP）是由河北師范大學(xué)提供的含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（EGFP）的載體PEGAD，將其35S啟動(dòng)子替換為ubiquition啟動(dòng)子改造（圖1），所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，由河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 種子發(fā)芽? 先用無菌水沖洗玉米種子2次，每次7 min，用0.1%HgCl2消毒13 min， 用無菌水沖洗5遍，每次2 min。將經(jīng)過消毒清洗的玉米種子放在加有2層濾紙經(jīng)過高溫消毒的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），每培養(yǎng)皿放置20粒玉米種子，加8 mL水，加入濃度為2 mg/mL的乙酰丁香酮（AS）56 μL，設(shè)置4次重復(fù)，在23～25 ℃溫度條件下暗培養(yǎng)4～5 d，挑選2種不同大小的種子芽用于轉(zhuǎn)化處理。

1.2.2? 活化農(nóng)桿菌侵染液配制? 50 mL LB液體培養(yǎng)基+50 mg/L卡那霉素+40 mg/L利福平+0.1 mL農(nóng)桿菌菌液，28 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600 nm=0.5時(shí)，5 ℃、4 000 r/min進(jìn)行菌液離心5 min，去上清液后加入0.5 mL的GSH侵染基液（高滲侵染基液）+0.1 mmol/L AS+0.1 mg/L普朗尼克F68（轉(zhuǎn)化前30 min進(jìn)行侵染液準(zhǔn)備），配制成農(nóng)桿菌侵染液。

1.2.3? 轉(zhuǎn)化處理培養(yǎng)及檢測? 根據(jù)玉米芽的長度大小設(shè)置成2個(gè)處理，處理1、處理2芽長分別為0.3～0.5、0.5～1.0 cm，將玉米種子芽剝出生長點(diǎn)，置于加有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每只培養(yǎng)皿放置8～9粒玉米種子，在-18 ℃條件下處理20 min，開蓋風(fēng)干30～50 min，滴加2 μL農(nóng)桿菌侵染液，再風(fēng)干50～55 min，每培養(yǎng)皿加1.5 mL無菌水，加蓋后封口，在23～25 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d，光照培養(yǎng)4 d后調(diào)查發(fā)芽情況和檢測熒光蛋白。將轉(zhuǎn)化的玉米種子芽移栽到蛭石中，繼續(xù)進(jìn)行光照培養(yǎng)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 轉(zhuǎn)化后的發(fā)芽情況

轉(zhuǎn)化后玉米發(fā)芽情況如表1所示，處理1的發(fā)芽率比處理2的發(fā)芽率高24個(gè)百分點(diǎn)，與處理2相比，處理1再生的芽更長（圖2），表明利用較小的玉米芽進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，在生長點(diǎn)被轉(zhuǎn)化后更容易再長出芽發(fā)育成玉米植株，表現(xiàn)出較強(qiáng)的分化再生能力。即用較小的芽轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的發(fā)芽率更高，有利于獲得較多的植株。

2.2? 玉米芽大小對轉(zhuǎn)化效果的影響

對轉(zhuǎn)化后玉米芽的綠色熒光蛋白進(jìn)行檢測，從綠色熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度（圖3）來看，兩種處理的差異不大，表明轉(zhuǎn)化芽中陽性細(xì)胞的嵌合程度差異不大，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化種子芽生長點(diǎn)0.3～1.0 cm，受體材料對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化程度沒有差異，但在此基礎(chǔ)上由于處理1轉(zhuǎn)化后能夠得到的玉米芽更多，獲得的陽性芽率較處理2提高16個(gè)百分點(diǎn)，表明利用較小的玉米芽轉(zhuǎn)化更有利于獲得轉(zhuǎn)基因植株。

3? 小結(jié)

除玉米芽的大小外，在其他轉(zhuǎn)化條件相同的情況下，利用長度為0.3～0.5 cm的玉米芽生長點(diǎn)作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，不僅有利于轉(zhuǎn)化后玉米芽的再生，還不影響農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效果，在轉(zhuǎn)化相同數(shù)量受體的情況下可以獲得更多的轉(zhuǎn)化植株，是較理想的玉米芽生長點(diǎn)轉(zhuǎn)化受體材料。

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