郭東梅，李耘，邱靜，許彥陽(yáng)，楊桂玲，王強(qiáng)， 錢永忠,*

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081

農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病、蟲和草害、促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)和保證增產(chǎn)增收方面起了積極作用。但是大量使用的農(nóng)藥可以通過(guò)雨水沖刷等不同的途徑進(jìn)入水體，污染水資源，給水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成嚴(yán)重影響[1-3]。氯氰菊酯被廣泛用于防治棉花、水果和蔬菜等的多種害蟲[4-5]。氯氰菊酯雖然在土壤中有較高的疏水性和較高的穩(wěn)定性，但是它很容易通過(guò)徑流和土壤侵蝕運(yùn)輸?shù)剿鷳B(tài)系統(tǒng)中[6-7]。馬拉硫磷是一種常用的有機(jī)磷類殺蟲劑，用以防治水果、蔬菜上的主要蟲害[8-9]。殺螟硫磷具有神經(jīng)毒性，可抑制膽堿酯酶和刺激神經(jīng)系統(tǒng)[10]。咪鮮胺是一類被廣泛應(yīng)用的咪唑類殺菌劑，能夠抑制麥角甾醇生物合成[11-15]。在水生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥往往是以復(fù)合污染物的形式存在。氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺等大量使用，其殘留污染在水生環(huán)境中時(shí)常被檢測(cè)到[16-17]，且經(jīng)常共存于水體中。

斑馬魚個(gè)體小，繁殖周期短，胚胎透明便于觀察，與人類基因同源性高達(dá)87%以上，因此，在毒理學(xué)研究中常作為模式生物。目前，關(guān)注單一污染物毒性作用的研究較多，而探究污染物聯(lián)合毒性效應(yīng)的相對(duì)較少[18]。筆者以斑馬魚仔魚為模式生物，研究了氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺對(duì)斑馬魚仔魚的急性毒性，以及4種農(nóng)藥的二元、三元和多元復(fù)合污染對(duì)斑馬魚仔魚的聯(lián)合毒性效應(yīng)，以期為復(fù)合污染的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估提供一定的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器和試劑

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(浙江拱東醫(yī)療科技有限公司)；光照培養(yǎng)箱(三洋MLR-350HT)；體視顯微鏡(Leica L2型)。

95%氯氰菊酯乳油、97%咪鮮胺粉劑和95%馬拉硫磷乳油由南京紅太陽(yáng)有限公司生產(chǎn)；95%殺螟硫磷乳油由臺(tái)州黃巖永寧農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)；純度為99%的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；純吐溫-80由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺原藥用吐溫-80和DMF溶解，經(jīng)超聲混勻定容配制為10 000 μg·L-1的母液，放在-4 ℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

斑馬魚AB品系購(gòu)買于武漢中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家斑馬魚資源中心。斑馬魚分別在每天早、中和晚喂食新孵化的豐年蝦。魚飼養(yǎng)在活性炭過(guò)濾并充分曝氣的水循環(huán)系統(tǒng)中，水溫為(26±1) ℃，pH為8.34，光/暗比為14 h∶10 h，總硬度為28～32 DH。本試驗(yàn)所用斑馬魚仔魚為種魚繁殖所得。在倒置顯微鏡下挑選各臟器都已形成、無(wú)異常受精后6日齡的仔魚進(jìn)行毒性試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單一農(nóng)藥對(duì)斑馬魚仔魚染毒試驗(yàn)

參考OECD TG 203[19]方法，將氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺母液分別用實(shí)驗(yàn)室的曝氧水以1.5倍濃度梯度間隔稀釋成一系列梯度溶液。采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入2.5 mL測(cè)試溶液，并移入一個(gè)發(fā)育正常的仔魚。以稀釋水為空白對(duì)照組，1個(gè)24孔板為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)。為了防止溶液揮發(fā)，測(cè)試的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板用膠帶密封。

染毒期間，仔魚放入溫度為(26±1) ℃、光/暗比為14 h∶10 h的恒溫培養(yǎng)箱中。在染毒試驗(yàn)期間，仔魚不被喂養(yǎng)。為了確保試驗(yàn)期間藥劑濃度不變，每隔24 h更換藥液一次，并于染毒后的24、48、72和96 h觀察仔魚死亡數(shù)。在顯微鏡下觀察，仔魚無(wú)心跳被判斷為死亡(OECD, 1998)[20]。

1.3.2 農(nóng)藥混合污染對(duì)斑馬魚仔魚染毒試驗(yàn)

氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺的二元、三元及多元混合污染對(duì)斑馬魚仔魚的聯(lián)合毒性測(cè)試，依據(jù)單一農(nóng)藥對(duì)斑馬魚仔魚96 h-LC50值為一個(gè)毒性單位，按照等毒比(1∶1)進(jìn)行混合配制?；旌限r(nóng)藥用實(shí)驗(yàn)室的曝氧水以1.5倍濃度梯度間隔稀釋成一系列梯度溶液，試驗(yàn)具體方法同1.3.1部分。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)斑馬魚仔魚在一定濃度下的死亡數(shù)，利用DPS軟件計(jì)算農(nóng)藥的毒力回歸方程，并確定農(nóng)藥的LC50值及其95%置信限。

采用Marking相加指數(shù)法[21]來(lái)判定農(nóng)藥的聯(lián)合毒性。生物毒性作用之和(S)計(jì)算公式為S=Am/Ai+Bm/Bi+Cm/Ci，式中：Am、Bm和Cm分別為混合物中各毒物的LC50；Ai、Bi和Ci分別為A、B和C毒物單獨(dú)作用時(shí)的LC50。

將S轉(zhuǎn)換成相加指數(shù)(additive index, AI)。當(dāng)S≤1時(shí)，AI=(1/S)-1.0；當(dāng)S>1時(shí)，AI=1.0-S。當(dāng)AI=0時(shí)為相加作用；當(dāng)AI>0時(shí)為大于相加作用，即協(xié)同作用；當(dāng)AI<0時(shí)為小于相加作用，即拮抗作用。

2 結(jié)果(Results)

2.1 單一農(nóng)藥對(duì)斑馬魚仔魚的毒性效應(yīng)

表1列出了單一農(nóng)藥氯氰菊酯、殺螟硫磷、馬拉硫磷和咪鮮胺對(duì)斑馬魚仔魚的LC50值。在染毒24、48、72和96 h時(shí)，4種農(nóng)藥對(duì)仔魚的致死作用都存在一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系，并且每種農(nóng)藥的LC50值隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)。氯氰菊酯對(duì)斑馬魚仔魚的毒性最高，屬于高等毒性，其96 h-LC50值為0.12 mg·L-1。馬拉硫磷對(duì)斑馬魚仔魚的毒性最低，屬于低等毒性，其96 h-LC50值為17.88 mg·L-1。在96 h時(shí)，氯氰菊酯對(duì)斑馬魚仔魚的毒性是馬拉硫磷毒性的149倍。各污染物對(duì)斑馬魚仔魚毒性次序?yàn)槁惹杈挣?咪鮮胺>殺螟硫磷>馬拉硫磷。

2.2 二元及多元農(nóng)藥混合污染對(duì)斑馬魚仔魚毒性效應(yīng)

氯氰菊酯、殺螟硫磷、馬拉硫磷和咪鮮胺的二元及多元混合污染聯(lián)合毒性效應(yīng)如表2～表7所示。根據(jù)單一農(nóng)藥對(duì)斑馬魚仔魚96 h-LC50的值，采用等毒性配比(1∶1)研究了二元、三元和多元農(nóng)藥復(fù)合污染對(duì)斑馬魚仔魚的聯(lián)合毒性效應(yīng)。在染毒24、48、72和96 h時(shí)，二元農(nóng)藥混合污染(氯氰菊酯+馬拉硫磷；氯氰菊酯+殺螟硫磷和氯氰菊酯+咪鮮胺)對(duì)斑馬魚仔魚的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用。氯氰菊酯+馬拉硫磷二元聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為3.10、2.13、2.09和1.96，然而隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)這種協(xié)同作用逐漸減弱。

殺螟硫磷+咪鮮胺二元農(nóng)藥混合污染對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為0.89、1.13、1.86和2.03，聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為協(xié)同作用，并且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)協(xié)同作用增強(qiáng)。殺螟硫磷+馬拉硫磷對(duì)斑馬魚仔魚的二元聯(lián)合暴露在24、48、72和96 h的相加指數(shù)分別為0.27、0.06、0.05和0.12，這2種農(nóng)藥的聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚仔魚在24 h的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，在48、72和96 h時(shí)聯(lián)合毒性表現(xiàn)為相加作用。馬拉硫磷+咪鮮胺二元農(nóng)藥對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為-1.19、-1.38、-1.86和-1.14，聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為拮抗作用。

表2 氯氰菊酯、馬拉硫磷和殺螟硫磷對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 2 The joint toxicity of cypermethrin, malathion and fenitrothion to zebrafish larvae

表3 氯氰菊酯、咪鮮胺和馬拉硫磷對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 3 The joint toxicity of cypermethrin, prochloraz and malathion to zebrafish larvae

表4 馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 4 The joint toxicity of malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表5 氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺混合污染對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 5 The joint toxicity of cypermethrin, malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表6 馬拉硫磷、殺螟硫磷、咪鮮胺和氯氰菊酯混合污染對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 6 The joint toxicity of malathion, fenitrothion, pochloraz and cypermethrin to zebrafish larvae

表7 四元農(nóng)藥混合污染對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合毒性Table 7 The joint toxicity of quaternary pesticide to zebrafish larvae

三元農(nóng)藥氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為6.52、3.69、5.54和4.71，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用；氯氰菊酯+馬拉硫磷+咪鮮胺對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為4.56、3.35、2.85和2.33，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)這種協(xié)同作用逐漸減弱。馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為2.57、2.45、2.23和2.03，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)這種協(xié)同作用逐漸減弱。咪鮮胺+氯氰菊酯+殺螟硫磷對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯(lián)合毒性相加指數(shù)分別為3.17、4.26、6.14和2.84，聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺四元農(nóng)藥復(fù)合污染對(duì)斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的相加指數(shù)分別為3.55、3.76、3.55和3.35，聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用。

3 討論(Discussion)

斑馬魚的不同生命階段(胚胎、仔魚、幼魚和成魚)均可以用來(lái)開展毒理學(xué)研究，但斑馬魚早期生命階段(胚胎和仔魚)對(duì)污染物的敏感性要高于其他生命階段(成年和幼魚)[22]。本研究中，斑馬魚仔魚在染毒24、48、72和96 h時(shí)，各污染物對(duì)斑馬魚毒性次序?yàn)槁惹杈挣?咪鮮胺>殺螟硫磷>馬拉硫磷。Bradbury和Coats[23]報(bào)道了在相同濃度下，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)魚的毒性是對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類的約1 000倍。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氯氰菊酯對(duì)魚類具有高毒性，一方面是由于魚鰓對(duì)農(nóng)藥有較高的吸收率和緩慢的水解率，另一方面是魚的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)這些農(nóng)藥有超敏感性[24]。

在真實(shí)的生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥污染物并不是以單體的形式存在，而是以混合污染物形式共同存在，較多的研究主要集中在單一污染物毒理效應(yīng)方面[25]。采用單一污染物進(jìn)行的毒性研究可能低估在復(fù)雜的混合污染環(huán)境中的毒性效應(yīng)，混合污染物可能產(chǎn)生復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)[26]。在本研究中，氯氰菊酯和有機(jī)磷類農(nóng)藥復(fù)合污染(氯氰菊酯+馬拉硫磷、氯氰菊酯+殺螟硫磷)比其他幾種二元農(nóng)藥的聯(lián)合作用表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的協(xié)同作用，可能是由于有機(jī)磷類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合共存時(shí)，有機(jī)磷類農(nóng)藥能與單加氧酶結(jié)合，導(dǎo)致分子的活化通過(guò)與單加氧酶結(jié)合，防止了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解。二元農(nóng)藥混合污染(氯氰菊酯+殺螟硫磷、氯氰菊酯+馬拉硫磷、氯氰菊酯+咪鮮胺和殺螟硫磷+咪鮮胺)對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合作用也均表現(xiàn)為協(xié)同作用。在水生態(tài)系統(tǒng)中這些污染物共同存在時(shí)，污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)可能增加。Liu等[27]開展了西草凈、除草定、環(huán)嗪酮、多果定、甲霜靈和殘殺威等6種農(nóng)藥的二元復(fù)合污染對(duì)小球藻和發(fā)光細(xì)菌的毒性研究，采用濃度相加(CA)模型作為參考模型，8種二元農(nóng)藥混合污染對(duì)發(fā)光細(xì)菌聯(lián)合作用表現(xiàn)協(xié)同作用，4種二元農(nóng)藥混合污染對(duì)小球藻聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗作用。也有研究表明，滅多威和辛硫磷對(duì)羅非魚的聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為協(xié)同作用[28]。

在筆者的研究中，所有三元農(nóng)藥(氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷、氯氰菊酯+馬拉硫磷+咪鮮胺、馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺和咪鮮胺+氯氰菊酯+殺螟硫磷)和四元農(nóng)藥(氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺)混合污染對(duì)斑馬魚仔魚聯(lián)合作用均表現(xiàn)為協(xié)同作用。Wang等[29]研究了氯氟氰菊酯、毒死蜱和辛硫磷3種殺蟲劑和乙草胺的多元混合污染對(duì)陸棲生物蚯蚓的聯(lián)合毒性，結(jié)果表明，大多數(shù)三元和四元農(nóng)藥混合暴露對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性作用均表現(xiàn)協(xié)同作用。在真實(shí)的生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥復(fù)合污染的聯(lián)合毒性作用不僅與污染物的組成和濃度有關(guān)，還與測(cè)試系統(tǒng)和染毒時(shí)間等多種因素有關(guān)，可以說(shuō)是一個(gè)很復(fù)雜的問(wèn)題。當(dāng)多種農(nóng)藥殘留污染共同時(shí)，對(duì)水生生物可能產(chǎn)生復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)，因此，未來(lái)研究中應(yīng)更多關(guān)注混合污染物的生態(tài)毒理效應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。