王繼陳，韓 嵐，張艷艷，彭代銀

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.安徽醫(yī)學高等專科學校，安徽 合肥 230601)

桃紅四物湯是活血化瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的經(jīng)典名方，由桃仁、紅花、當歸、川芎、熟地黃和白芍組成。現(xiàn)代藥理研究表明，桃紅四物湯中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯等成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗血小板活化等藥理作用[1-3]，臨床上可用于治療腦缺血、骨折、痛經(jīng)、產(chǎn)后病等疾病[4-7]。對此，建立桃紅四物湯質(zhì)量控制標準十分必要，現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(2015年版)中無桃紅四物湯的質(zhì)量控制標準，且目前關于桃紅四物湯質(zhì)量控制的研究較少，對成分的考察較為片面，只選擇某一部位或者某一類成分進行考察[8-11]，且忽視中藥復方整體性、復雜性的特點，仍然需要進一步研究。本研究采用超高效液相色譜法建立同時測定羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯6種成分含量的方法，為桃紅四物湯的質(zhì)量標準研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 1290 Infinity超高效液相色譜儀[包括G4220A 1290 Bin Pump(系列號DEBAA05426)四元泵、G1316C 1290TCC(系列號DEBAC10714)柱溫箱、G4226A 1290Samper(系列號DEBAP06788)自動進樣器、G4212A 1290DAD(系列號DEBAF04086)檢測器]：美國安捷倫公司；CascadaⅠ超純水儀：美國頗爾公司；5417R型離心機：德國艾本德公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：德國梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：中國南通金石實驗儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴鍋：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；超聲儀：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 羥基紅花黃色素A(批號 wkq16070605)、苦杏仁苷(批號 160210)、芍藥苷(批號 150920)、阿魏酸(批號 150526)、毛蕊花糖苷(批號 wkq16062004)、藁本內(nèi)酯(批號 wkq16051404)：四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈：瑞典歐森巴克化學公司；超純水：自制；乙醇：上海潤捷化學試劑有限公司；醋酸銨：上海麥克林生化科技有限公司；醋酸：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3 飲片 熟地黃(批號 1705312、170906、170618)：河南；當歸(批號 161108、161223、170514)：甘肅；川芎(批號 1701033、170712、170902)：四川；白芍(批號 1711011、1711025、180116)：安徽；桃仁(批號 1702181、1708011、1711003)：河北；紅花(批號 1707213、17090121、1712014)：新疆。以上各批次6味藥材均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學生藥教研室俞年軍教授鑒定。

2 方法和結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯適量，甲醇定容，制成分別含羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯0.50、0.51、0.86、0.47、0.51、0.50 mg/mL的混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備 依據(jù)《方劑學》(第7版)[12]，按熟地黃、當歸、白芍、川芎、桃仁、紅花質(zhì)量比為4∶3∶3∶2∶3∶2的比例共稱取17 g藥物，煎煮制備供試品溶液。按同樣方法，共稱取3批，各加入10倍量(容積與質(zhì)量之比)75%乙醇回流提取2 h，濾過，濾渣用8倍量75%乙醇繼續(xù)回流提取2 h，合并兩次濾液，濃縮，75%乙醇定容至50 mL量瓶中，精密吸取1 mL轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，超純水稀釋至刻度，精密吸取2 mL于離心管內(nèi)，15 000 r/min高速離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，共制備3批供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用美國安捷倫公司1290 Infinity超高效液相色譜儀，G4212A 1290DAD(Serial No. DEBAF04086)檢測器，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動相：含7.84 mmol/L乙酸銨的0.05%乙酸水(A)和甲醇溶液(B)。流速：0.2 μL/min。進樣量：2 μL。柱溫：25 ℃。檢測波長：0～4.5 min，403 nm；4.5～9 min，403 nm(用于檢測羥基紅花黃色素A)和210 nm(用于檢測苦杏仁苷)；9～13 min，230 nm；13～18 min，283nm；18～30 min，328 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取混合對照品溶液，依次向下稀釋2.5、5、12.5、25、62.5倍，按“2.3”項下色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖，分別以濃度(x)對峰面積(y)進行線性回歸，回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)見表2，結(jié)果表明進樣量與峰面積有良好的線性關系。

表2 線性回歸方程

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液1 mL，過0.22 μm濾膜，取濾液，重復進樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.432%、1.265%、0.658%、0.718%、0.970%、0.734%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品溶液制備項下的方法制備成供試品溶液6份，在上述色譜條件下進行分析測定，結(jié)果顯示羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.765%、1.132%、0.633%、0.496%、1.267%、0.379%，結(jié)果表明方法的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 分別在0、2、4、6、8、12、24 h供試品溶液進樣2 μL，分別計算羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.172%、1.538%、0.845%、0.790%、1.872%、0.699%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取桃紅四物湯藥材9份，分別向其中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的對照品溶液(分別相當于藥材原有含量的50%、100%、150%)，每一質(zhì)量濃度取3份，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算結(jié)果見表3。結(jié)果表明該方法的準確度良好。

表3 6種成分的加樣回收率

續(xù)表3

2.5 桃紅四物湯有效成分含量測定 采用相同的桃紅四物湯藥液提取方法，3批次桃紅四物湯藥液應用所建立的方法每批重復進樣6次，并同時測定桃紅四物湯中的6種指標性成分，結(jié)果見表4。樣品和混標的超高效液相色譜圖見圖1。

表4 3批次樣品含量測定結(jié)果(n=6)

3 討論

阿魏酸具有明顯的抗氧化、抗炎等藥理活性[13-14]，可用于動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的治療[15-16]。桃仁是常用的活血化瘀藥物，苦杏仁苷作為其主要的活性成分，具有心血管保護、抗腫瘤、抗纖維化等廣泛的藥理作用。藁本內(nèi)酯能明顯減少腦缺血再灌注引起的腦梗死體積，改善腦神經(jīng)功能，并且能減輕大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞和海馬神經(jīng)細胞的損傷[17]，能夠舒張血管[18]，改善微循環(huán)[19]，具有很強的活血化瘀作用。羥基紅花黃色素A是發(fā)揮活血化瘀功效的主要有效成分，同時也是藥用紅花中最有效的水溶性成分[20]，對腦缺血、心肌缺血具有明顯的功效，同時也有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等廣泛的藥理活性。芍藥苷是中醫(yī)傳統(tǒng)補血藥白芍的主要藥理成分，國內(nèi)外研究已證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等多種生物學效應，并且毒性和不良反應較小[21]。毛蕊花糖苷為地黃中代表性苷類化合物，具有保肝、保護心腦血管、延緩衰老、改善記憶力等作用[22]。同時根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定，阿魏酸、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、毛蕊花糖苷分別為當歸、川芎、桃仁、紅花、白芍、熟地黃的質(zhì)量考察指標性成分[23]。因此，本研究選擇上述優(yōu)化的條件進行桃紅四物湯中6種發(fā)揮主要藥效的成分進行含量測定。

注：A1、B1、C1在4.5～9 min時檢測波長為403 nm，A2、B2、C2在4.5～9 min時檢測波長為210 nm；1.羥基紅花黃色素A；2.苦杏仁苷；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.毛蕊花糖苷；6.藁本內(nèi)酯

圖1空白甲醇(A)、混合對照品(B)和桃紅四物湯樣品(C)的高效液相色譜圖

單一中藥的分析通常使用單波長的檢測方法，因為主要標志成分通常只有一種或幾種化學成分，并且一般具有相似的紫外吸收波長。然而，對于由幾種甚至多達十幾種中藥組成的傳統(tǒng)復方，單波長定量分析可能是不夠的。以前對中藥復方的有效成分研究主要使用單一波長檢測或者定量樣品中少數(shù)化合物。采用多波長融合的方法更加適合對中藥傳統(tǒng)復方的質(zhì)量控制。參考《中華人民共和國藥典》(2015年版)，羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的最大吸收波長分別是403、210、230、316、334 nm[23]。藁本內(nèi)酯的最大吸收波長為280 nm和328 nm[24-25]?；诙O管陣列檢測器的全波長掃描結(jié)果，根據(jù)檢測成分的保留時間和吸收曲線，最終確定了283、403、210、230、328 nm共5種波長進行檢測，并選用乙酸銨-乙酸緩沖溶液作為離子調(diào)節(jié)劑，改善峰形，提高分離度。

本研究采用UPLC-DAD建立同時測定桃紅四物湯中6種指標成分含量的方法，具有重復性好、快速、準確的優(yōu)點，結(jié)果表明該方法適用于控制桃紅四物湯復方的整體質(zhì)量，為完善和豐富桃紅四物湯復方質(zhì)量標準提供了科學依據(jù)。