阮志燕 陳慶鳳 賴滿香

廣東食品藥品職業(yè)學院藥學院，廣東廣州 510520

鹽酸芬戈莫德（FTY720）作為一種新型免疫抑制劑治療器官移植[1]和多發(fā)性硬化[2]等免疫性疾病，主要激動S1P受體，從而具有特異性免疫抑制功能[3]。近年來，不斷有文獻報道FTY720可以抑制動物模型的腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]和增強抗癌藥的抗腫瘤活性[6]，抗瘤機制不盡相同，涉及鞘氨醇激酶、原癌基因等多個方面[7]。腫瘤細胞逃避患瘤機體的免疫殺傷作用一直是抗腫瘤免疫研究的重點，從提高機體抗腫瘤免疫的角度尋找有效的抗腫瘤藥物是目前的常規(guī)方法。選擇IFN-γ對腫瘤細胞的殺傷作用[8]和Tregs的免疫抑制功能[9]作為研究腫瘤免疫的主要指標。通過檢測免疫效應細胞分泌IFN-γ的量和Tregs的數(shù)量及免疫抑制功能的變化來觀察腫瘤機體的免疫狀態(tài)，結(jié)合藥物的抗瘤效果，對腫瘤模型的免疫狀態(tài)有重要的提示意義[10]。本研究著重于觀察鹽酸芬戈莫德對荷瘤小鼠腫瘤免疫相關(guān)因子效應T細胞、IFN-γ和Tregs細胞的影響，以期了解鹽酸芬戈莫德的抑制腫瘤作用。

1 資料與方法

1.1 細胞和藥物

小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26.WT（CT26）；鹽酸芬戈莫德（FTY720，純度≥98%）。

1.2 實驗動物

SPF級別雌性BALB/c小鼠，6～7周齡，體重（16±2）g，購自于廣東省實驗動物中心。

1.3 主要試劑和儀器

PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture（250×）（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），I型DNA酶和透明質(zhì)酸酶（上海易立生物科技有限公司），單克隆抗體FITC anti-mouse CD3e、PE-Cy7 anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD25、PE-Cy7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse IFN-γ、PE anti-mouse IL-10（美國eBioscience公司），流式細胞儀BD FACSCanto Ⅱ（美國BD公司）。

1.4 結(jié)腸癌小鼠模型的建立及抑瘤效果

使用隨機數(shù)字表對小鼠進行隨機分組，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組（n=10，共30只）和荷瘤模型組（n=10）接種CT26細胞，陰性對照組（n=10）接種生理鹽水。按CT26細胞數(shù)2×106個/只接種，接種后第4天，連續(xù)14d灌胃給藥。

1.5 腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測定

第14天給藥后24h處死小鼠，摘眼球取外周血、另外取胸腺、脾臟、接種側(cè)腋下淋巴結(jié)和腫瘤組織。胸腺、脾臟和腫瘤精密稱重后計算腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤效果使用抑瘤率表示，抑瘤率=（1-鹽酸芬戈莫德治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.6 小鼠不同組織效應T細胞CD8+CD3+T細胞的比例

在無菌條件下剝離腫塊，濾紙吸凈表面液體，剪碎，玻璃針芯輕柔碾壓，篩網(wǎng)過濾獲取組織細胞，使用膠原酶、DNA酶和透明質(zhì)酸酶消化6h，再用淋巴細胞分離液，獲得腫瘤組織來源的淋巴細胞。單克隆表面抗體CD3和CD8染色后上流式細胞儀檢測。

按照下列公式計算：Teff細胞數(shù)百分比=（CD3+CD8+細胞數(shù)/CD3+細胞數(shù)）×100%

1.7 小鼠不同組織T細胞的IFN-γ和CD4+CD25+Tregs IL-10的分泌

按流式細胞術(shù)處理外周血和淋巴結(jié)樣本取得相應細胞，將收集的外周血、淋巴結(jié)和腫瘤3種來源的淋巴細胞按5×104個細胞/孔鋪板，設置復孔3個，按說明書加入PMA/Ionomycin/BFA/Monensin mixture刺激，37℃，5%CO2，孵育過夜。CD3、CD4和CD25標記Treg細胞，分別進行細胞表面抗原染色和細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ和IL-10染色。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0 for Windows軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)組間比較采用方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較使用q檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

荷瘤模型組剝離的腫塊平均重量為（0.99±0.27）g，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組的抑瘤率呈劑量正相關(guān)性，最高達61%，最低為33%，提示FTY720有抑制小鼠實體腫瘤的生長的作用，F(xiàn)TY720高、中、低劑量治療組、荷瘤模型組組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=30.928，P＜0.05），F(xiàn)TY720不同劑量組和荷瘤模型組比較，腫瘤重量明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 FTY720的抑瘤率（n=10）

2.2 FTY720對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

和陰性對照組的數(shù)據(jù)相比，小鼠接種CT26腫瘤細胞后胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；和荷瘤模型組的臟器指數(shù)相比，不同劑量給藥組明顯提高了小鼠的胸腺指數(shù)（F=15.965）和脾臟指數(shù)（F=14.413），尤其是高劑量組的小鼠臟器指數(shù)上升更為顯著，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 FTY720對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10）

2.3 FTY720對荷瘤小鼠腫留免疫相關(guān)因子的影響

2.3.1 小鼠不同組織中的CD8+CD3+T細胞的比例 荷瘤模型組外周血和淋巴結(jié)中Teff細胞的比例顯著高于陰性對照組；FTY720不同劑量治療組與荷瘤模型組的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，治療組的外周血（F=59.636）和淋巴結(jié)（F=52.952）Teff細胞的比例均是下降的，并且下降趨勢與劑量呈相關(guān)性；觀察腫瘤局部Teff細胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720高、中劑量治療組與荷瘤模型組的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（F=52.985，P ＜ 0.05）。見表 3。

表3 不同組織內(nèi)CD8+CD3+Teff細胞百分比（n=8）

2.3.2 小鼠不同組織CD3+T細胞的IFN-γ的分泌 荷瘤模型組的外周血中和淋巴結(jié)中的CD3+T細胞分泌IFN-γ的比例均比陰性對照組的數(shù)據(jù)低。不同劑量治療組的數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)TY720顯著升高三種不同組織來源的CD3+T細胞分泌IFN-γ的比例，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并且升高的數(shù)值隨著用藥劑量而變化。見圖1。

圖1 分泌IFN-γ的CD3+T細胞百分比

2.3.3 小鼠不同組織CD4+CD25+Tregs的IL-10分泌 荷瘤模型組的小鼠外周血和淋巴結(jié)的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的比例相比陰性對照組顯著升高，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；鹽酸芬戈莫德顯著降低了CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細胞比例，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），用藥劑量越大，降低比例越明顯，提示鹽酸芬戈莫德可以通過減少IL-10的分泌來對抗腫瘤小鼠CD4+CD25+Tregs的免疫抑制作用。見圖2。

圖2 分泌IL-10的CD4+CD25+Tregs細胞百分比

3 討論

我們分別從效應T細胞的數(shù)量和腫瘤免疫相關(guān)的關(guān)鍵細胞因子兩個方面，研究鹽酸芬戈莫德對結(jié)腸癌小鼠腫瘤免疫相關(guān)因子的影響。從實驗結(jié)果來看，鹽酸芬戈莫德升高了腫瘤局部CD3+CD8+T細胞的比例，這些小鼠外周血和淋巴結(jié)、甚至腫瘤局部的CD3+T細胞分泌IFN-γ的比例明顯增強；Sasidharan報道Tregs在局部造成的免疫抑制微環(huán)境是幫助腫瘤細胞逃避免疫殺傷的關(guān)鍵[11]，腫瘤局部Tregs和CD8+T細胞的此消彼長影響腫瘤的生長[12]；CD8+T的細胞數(shù)量和IFN-γ的分泌量是衡量機體抗腫瘤免疫的常見指標，治療組的數(shù)據(jù)提示鹽酸芬戈莫德有提高CD8+T的細胞數(shù)量和IFN-γ的分泌量的作用。

另外一方面，Tregs在腫瘤機體的免疫抑制作用不只是存在于腫瘤局部，其分泌的細胞因子IL-10也是抑制抗腫瘤免疫的主要指標[13]，在小鼠外周血和腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)中的CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的能力增強，意味著荷瘤小鼠腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)較強，實驗數(shù)據(jù)顯示鹽酸芬戈莫德顯著降低了外周血和腫瘤引流淋巴結(jié)CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細胞比例，可能在腫瘤免疫中起到抑制Tregs功能的作用。

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是反映小鼠機體整體免疫狀態(tài)的常用指標[14]，檢測臟器指數(shù)從側(cè)面反映鹽酸芬戈莫德對結(jié)腸癌小鼠腫瘤免疫狀態(tài)的影響。荷瘤模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)數(shù)據(jù)顯示機體免疫狀態(tài)受到明顯抑制，鹽酸芬戈莫德明顯改善因腫瘤導致的臟器指數(shù)下降。

我們推測腫瘤的生長受到抑制與以下幾個方面相關(guān)：胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)回升、CD3+CD8+T細胞的比例提高、CD3+T細胞分泌IFN-γ的水平增強以及CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的細胞比例下降。這些數(shù)據(jù)提示鹽酸芬戈莫德可能加強了荷瘤機體的抗腫瘤免疫反應，增強了免疫效應細胞的數(shù)量和功能，抑制了Tregs免疫抑制功能和腫瘤局部Tregs的數(shù)量，從而抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長。

目前鹽酸芬戈莫德的作用靶點尚不清楚，但是其對Tregs的影響是比較明顯的，其機制可能是鹽酸芬戈莫德影響了Tregs向腫瘤局部的遷徙[15]。我們的研究也表明，鹽酸芬戈莫德對結(jié)腸癌模型小鼠體內(nèi)腫瘤免疫因子的影響，提高外周血和淋巴結(jié)中T細胞分泌IFN-γ的能力，同時抑制CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的作用來發(fā)揮作用，這一結(jié)果與Zhao等[16]報道的炎癥性腸病的結(jié)果類似。