胡曉，李濟彤，常靜，郭寶元，王會利,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

三唑類殺菌劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和人類真菌病防治領(lǐng)域，它們主要通過阻斷真菌細胞壁的生成來抑制真菌的生長[1]。由三唑類殺菌劑的使用量巨大并且在環(huán)境中具有一定的持久性，它們在土壤、水和植物等環(huán)境介質(zhì)中被不斷檢出，因此，三唑類殺菌劑引起的環(huán)境健康和生態(tài)毒理學(xué)問題逐漸成為人們關(guān)注的焦點[2]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)唑醇、氟環(huán)唑和丙環(huán)唑暴露于大鼠能引起肝細胞過度增殖、肝組織肥大等現(xiàn)象，具有明顯的肝毒性[3]。此外，Lin等[4]發(fā)現(xiàn)，腈菌唑和三唑酮能夠誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)CYP3A酶的活性并且刺激芳香烴受體(AhR)的表達量增加，導(dǎo)致子代數(shù)目減少、性腺重量增加。三唑醇(triadimenol, TN)是一種典型手性三唑類殺菌劑，它含有2個手性中心，4個手性單體，包括TN-A(A1(R,S)和A2(S,R))，TN-B(B1(R,R)和B2(S,S))，其中A1和A2對映體各約占35%，B1和B2對映體各約占15%。一般來說，手性對映體之間具有相同的物理、化學(xué)性質(zhì)，但是在生物體內(nèi)的手性環(huán)境中，不同對映體往往在吸收、分布和代謝等方面存在差異[5]。已有的研究表明，三唑醇4種對映體在土壤、植物、微生物和魚體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)化和降解都表現(xiàn)出明顯的對映選擇性，這說明4種對映體在生物體內(nèi)的活性具有明顯的差異[6-7]。

近年來，全球爬行動物的數(shù)量出現(xiàn)明顯的下降，全球氣候變化、棲息地減少和環(huán)境污染等被認為是導(dǎo)致爬行動物數(shù)量下降的主要原因[8]。而農(nóng)藥作為世界上應(yīng)用最廣泛、使用量最多、使用時間最長的化學(xué)品，是陸地環(huán)境中最主要污染物之一。但是目前關(guān)于農(nóng)藥對爬行動物的生態(tài)毒理學(xué)研究還很少，鳥類通常作為爬行動物生態(tài)毒理學(xué)研究的替代模型。然而有研究表明，爬行動物對一些化學(xué)品更為敏感，并且其暴露方式也和鳥類有一定的差異，以鳥類作為爬行動物的替代模型并不準確[9-10]。蜥蜴是爬行動物中種群數(shù)量最多的物種，它們生活在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，可以通過呼吸、皮膚和飲食等方式直接暴露于農(nóng)藥。由于它們棲息地廣泛、對環(huán)境污染物敏感，蜥蜴被認為是爬行動物生態(tài)毒理學(xué)評價的潛在模型。麗斑麻蜥是中國的本土生物，主要分布在長江北部。由于它們體型小，易于在實驗室條件下喂養(yǎng)，近年來，麗斑麻蜥已經(jīng)被一些研究用來評價環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)[11-12]。

目前仍然缺乏三唑醇在爬行動物體內(nèi)的毒性效應(yīng)和對映選擇性行為方面的研究，本實驗分別以雄性麗斑麻蜥短期暴露和長期暴露于三唑醇，從對映體層面考察4種單體在麗斑麻蜥體內(nèi)的代謝降解和生物蓄積規(guī)律，通過測定肝臟中代謝相關(guān)基因的表達量和組織病理學(xué)切片，評價三唑醇對麗斑麻蜥肝毒性效應(yīng)，進而綜合評價三唑醇對爬行動物的生態(tài)毒理學(xué)風(fēng)險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)品和試劑

三唑醇外消旋體(純度>98.9%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，保存在甲醇(分析純)中，外消旋體由35% A1、35% A2、15% B1和15% B2組成，4 ℃避光儲存。所有的化學(xué)試劑，包括甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、三氯甲烷和正己烷(均為分析純)，購買自迪瑪科技有限公司(北京)。

1.2 麗斑麻蜥的飼養(yǎng)

本實驗室自2009年起即建立了完善的麗斑麻蜥飼養(yǎng)體系，蜥蜴生活在5 m×1.2 m×0.4 m的玻璃培養(yǎng)箱中，底部填有10 cm厚的細砂土。每個玻璃培養(yǎng)箱均配備6個紫外燈，控制光暗時間比為14 h∶10 h，玻璃箱的溫度控制在25～30 ℃，濕度控制在30%～40%。蜥蜴每天喂食活的黃粉蟲(Tenebriomolitor)，每2天灑一次水，清理玻璃箱中的排泄物。本實驗中，選擇健康、體重相近(3～4 g)和性成熟的成年(2～3歲)雄性麗斑麻蜥，在實驗開始前將所選蜥蜴轉(zhuǎn)移至50 cm×50 cm×40 cm的塑料培養(yǎng)箱中，在相同條件下培養(yǎng)適應(yīng)2周。

1.3 暴露實驗

目前缺乏三唑醇對爬行動物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，而鳥類一般作為爬行動物風(fēng)險評估的替代物種，Hao等[13]在腈菌唑的研究中發(fā)現(xiàn)，鳥類半致死劑量(LD50)的5%作為暴露濃度是麗斑麻蜥的敏感濃度，能夠引起明顯的生理反應(yīng)。此外，Wang等[11]通過亞慢性暴露實驗(14 d)發(fā)現(xiàn)，三唑酮對麗斑麻蜥的最高非致死劑量為200 mg·kg-1body weight，Li等[14]以麗斑麻蜥暴露于100 mg·kg-1bw三唑酮21 d，未出現(xiàn)明顯的致病和致死效應(yīng)。由于三唑醇是三唑酮在生物體內(nèi)的主要代謝物，其毒性與三唑酮相近，因此本實驗選擇三唑醇對鳥類(LD50)的5%，即100 mg·kg-1bw作為實驗劑量。

隨機選擇21只蜥蜴，用平口注射器一次經(jīng)口暴露100 mg·kg-1bw三唑醇外消旋體，分別于暴露后1、2、4、6、12、24和48 h將蜥蜴于二氧化碳培養(yǎng)箱中安樂死，每個時間點隨機選取3只蜥蜴，提取蜥蜴的各個組織，包括肝、大腦、性腺、腎、皮膚和尾，將組織稱重后保存在-20 ℃冰箱中。

隨機選取9只蜥蜴分為空白對照組和2個暴露組，每組3只，暴露組蜥蜴每2天經(jīng)口暴露一次100 mg·kg-1bw三唑醇外消旋體，暴露28 d后提取暴露組蜥蜴的肝、大腦、性腺、腎、皮和尾，稱重后保存于-20 ℃，用于測定組織殘留；提取空白對照組和暴露組蜥蜴的肝組織，分別切下一小片保存在4%多聚甲醛中用于組織病理學(xué)分析，余下肝組織置于RNA保存液中，于-80 ℃保存用于相對基因表達量分析。

1.4 化學(xué)分析

將蜥蜴的各個組織用生理鹽水沖洗干凈，在-70 ℃冷凍干燥機中去除水分后轉(zhuǎn)移到50 mL聚丙烯離心管中。加入10 mL乙腈作為提取劑，將組織破碎后渦旋2 min使其與乙腈充分混合。然后在離心機上離心(1 000 g、5 min)、靜置后將上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。重復(fù)上述提取步驟，合并上清液至分液漏斗中。然后向分液漏斗中加入20 mL正己烷用于液液萃取以去除大部分脂肪。收集分液漏斗下層液體至圓底燒瓶中，40 ℃下旋蒸至即將蒸干，然后采用氮吹儀將殘留液體吹干。向圓底燒瓶中加入1 mL甲醇溶解殘渣，充分震蕩混勻后經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中。

使用菲羅門Lux Cellulose-1手性柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)在TSQ QUANTUM ACCESS MAX高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世尓科技公司，美國)上檢測三唑醇4種對映體在樣品中的含量，流動相為V(甲醇)∶V(水)=68∶32，流速為0.5 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫40 ℃，吹掃電壓3 500 V，鞘氣流量35 arb，毛細管溫度320 ℃。質(zhì)譜掃描模式為平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)，三唑醇一級質(zhì)譜特征離子質(zhì)荷比(m/z)為296.10，二級質(zhì)譜特征離子質(zhì)荷比為43.60和70.04。

將0.1、1和10 mg·kg-1濃度的三唑醇加入到空白組織中，采用相同的提取、檢測方法測定回收率，結(jié)果顯示4種對映體的回收率都在81.5%～118.3%之間，回收率標準差(RSD)均小于5%，表明上述提取方法可行。

1.5 基因表達量測定

使用TRNzol A+試劑(北京天根生化科技有限公司)遵照操作規(guī)程提取性腺組織中的總RNA，利用Nano-drop-2000分光光度計測定所得RNA的濃度和純度。使用Fastking RT試劑盒(含gDNase)(北京天根生化科技有限公司)，依據(jù)操作手冊對2 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL。

使用Talent qPCR PreMix (SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司)試劑盒和MX3005P型熒光定量PCR儀(Stratagene, USA)對肝臟中代謝相關(guān)基因進行實時定量PCR，相關(guān)基因的引物序列均來源于美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)Chang等[15]的研究，β-actin基因在蜥蜴各個組織中的表達量十分穩(wěn)定，因此采用β-actin作為管家基因，對目標基因的表達量進行相對定量。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進行反應(yīng)，首先在95 ℃下預(yù)變性3 min，PCR反應(yīng)階段首先在95 ℃、5 s條件下變性，最后60 ℃、15 s條件下退火和延伸，反應(yīng)經(jīng)歷40個循環(huán)后終止。對每個基因的擴增進行熔解曲線分析，保證基因的特異性擴增。采用2-△△Ct方法計算目標基因的相對表達量。

1.6 組織病理學(xué)分析

將肝組織樣品放在固定液中固定，用乙醇進行脫水，然后使石蠟侵入組織中，將侵蠟后的組織置于融化的固體中包埋，將包埋后的組織切為6 mm后的切片，然后用蘇木精和伊紅(H&E)染色，具體程序為：脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明和封固，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)特征。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 9.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示。采用獨立樣本T檢驗(independentT-test)方法分析暴露組和對照組之間的差異，*P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 三唑醇在麗斑麻蜥體內(nèi)的對映選擇性降解

雄性麗斑麻蜥一次經(jīng)口暴露于三唑醇外消旋體(100 mg·kg-1bw)后，三唑醇被迅速吸收，并分布到體內(nèi)的各個組織，但是在不同組織中達到最高濃度的時間不同。從圖1可以看出，肝臟和尾巴中三唑醇濃度在暴露后1 h即達到最高濃度，大腦、腎和皮膚中的三唑醇在4 h達到最高濃度，而性腺中的三唑醇濃度在暴露后12 h達到最大值?？傮w來說，進入大腦和腎組織的三唑醇濃度明顯低于其他組織，在暴露后48 h蜥蜴各個組織中的三唑醇基本被代謝完畢。三唑醇具有較強的親脂性(logKow= 3.18)，因此易于在各個組織中分配轉(zhuǎn)移，同時實驗結(jié)果顯示，三唑醇能夠穿過血腦屏障進入大腦中，而已有的研究表明，三唑醇能夠抑制大鼠腦中多巴胺的吸收，引起小鼠行為異常，具有明顯的神經(jīng)毒性，因此，三唑醇也可能會對麗斑麻蜥的神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[16]。

三唑醇外消旋體包含35% A1、35% A2、15% B1和15% B2，從圖1中可以看出，B1和B2對映體在各個組織中具有相似的降解速率，各個時間點的濃度相近。但是，在暴露初始階段(1 h)，肝和尾中A1對映體的濃度明顯高于A2，隨著代謝時間的延長(1～24 h)，各個組織中A1的濃度都顯著高于A2，而在代謝后期(24～48 h)，A1和A2的濃度又趨于相等。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因一方面可能是由于A2在蜥蜴組織中的代謝速率高于A1，導(dǎo)致其濃度下降更快，另一方面可能是A2對映體在蜥蜴體內(nèi)被轉(zhuǎn)換為A1，導(dǎo)致2種對映體的濃度產(chǎn)生差異。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，三唑醇作為三唑酮在生物體內(nèi)的主要代謝物，在蜥蜴中存在手性轉(zhuǎn)換的可能性[12]。Gao等[17]針對苯霜靈(benalaxyl)的研究發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲(Tenebriomolitor)單獨暴露于S-benalaxyl和R-benalaxyl后都會發(fā)生明顯手性轉(zhuǎn)換，并且在暴露初期2種對映體濃度差異增加，而在后期又趨于相等。對映體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性主要與碳原子得失質(zhì)子難易狀態(tài)有關(guān)[18]，三唑醇A1和A2對映體之間的轉(zhuǎn)換與苯霜靈對映體轉(zhuǎn)換相似，主要與2個手性碳上氫的脫除和增加有關(guān)，不涉及其他電負性強的基團，同時由于鹵代苯環(huán)、羥基和甲基等存在(圖1)，手性碳附近電子云密度不均勻，可能會降低氫原子脫除和添加的難度，這些均有利于A1和A2之間的轉(zhuǎn)換。此外，在暴露后12 h，肝、腎、皮膚和尾中A1對映體的濃度出現(xiàn)二次上升，而其他對映體的濃度仍在下降，這可能是由于經(jīng)過一段時間的代謝以后體內(nèi)循環(huán)以A1對映體為主，在肝腸循環(huán)作用下被二次吸收，導(dǎo)致其濃度出現(xiàn)明顯上升，而其他對映體的濃度較低，沒有受到肝腸循環(huán)作用的明顯影響。

2.2 三唑醇在麗斑麻蜥不同組織中的蓄積

將三唑醇外消旋體(100 mg·kg-1bw)長期暴露(28 d)于麗斑麻蜥后，三唑醇在蜥蜴體內(nèi)各個組織的蓄積狀況如圖2所示?？梢钥闯觯虼荚谛韵僦袩o殘留，在腎中僅A1對映體有少量殘留(<1 mg·kg-1)，大腦中4種對映體的濃度均低于1 mg·kg-1，肝臟中A1對映體(2.6 mg·kg-1)和A2對映體(4.0 mg·kg-1)的濃度明顯高于B1和B2對映體(<1 mg·kg-1)。皮膚和尾中三唑醇對映體的濃度(18～140 mg·kg-1)明顯高于其他組織，這說明皮膚和尾是主要的蓄積器官。一般來說，蜥蜴具有穩(wěn)定的蛻皮周期，這種特性能夠不斷將皮膚中的有毒物質(zhì)排除。蜥蜴的尾巴主要負責機體的運功和協(xié)調(diào)功能，遠離肝臟和心臟等重要器官，并且可以斷尾再生。因此，三唑醇蓄積在皮膚和尾巴中可能會最大程度降低它對機體的影響。雖然三唑醇在不同組織中的濃度有差異，但是可以看出在各個組織中A1與A2對映體濃度相近，B1與B2對映體濃度相近，這表明，三唑醇在各個組織中仍然維持外消旋狀態(tài)，這與其他手性物質(zhì)的研究結(jié)果相似，即手性物質(zhì)在體內(nèi)趨向于以外消旋狀態(tài)穩(wěn)定存在。

圖1 三唑醇一次經(jīng)口暴露(100 mg·kg-1 bw)后在雄性麗斑麻蜥各個組織內(nèi)的代謝降解過程注：A1表示(R,S)，A2表示(S,R)，B1表示(R,R)，B2表示(S,S)。Fig. 1 The degradation of triadimenol in different tissues of male Eremias argus after one-time exposure to 100 mg·kg-1·bw triadimenolNote: A1 represents (R,S); A2 represents (S,R); B1 represents (R,R); B2 represents (S,S).

2.3 三唑醇對麗斑麻蜥肝臟的影響

CYP450酶是肝中負責外源性物質(zhì)代謝的最主要酶之一，其中，CYP1, 2和3家族參與了將近70%～80%外源性物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化[19]。AhR是一種重要的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，可以介導(dǎo)多環(huán)芳烴類化合物的毒性反應(yīng)，是二噁英類物質(zhì)在體內(nèi)的主要受體[20]。三唑類一般含有氯代苯環(huán)和三唑環(huán)，與二噁英類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮和腈菌唑能刺激斑馬魚肝體內(nèi)AhR受體的活性，說明三唑類物質(zhì)可能與二噁英具有相似的毒性。

圖2 三唑醇外消旋體(100 mg·kg-1 bw)暴露28 d后在雄性麗斑麻蜥體內(nèi)的蓄積圖Fig. 2 The bioaccumulation of triadimenol enantiomers in male Eremias argus after exposure to 100 mg·kg-1 bw triadimenol for 28 d

本實驗中，如圖3所示，雄性麗斑麻蜥暴露于三唑醇28 d后，肝中AhR基因的相對mRNA表達量無明顯變化，說明三唑醇代謝不依賴AhR介導(dǎo)的信號通路，其在蜥蜴體內(nèi)的代謝方式與二噁英類物質(zhì)不同。三唑醇暴露后肝臟中cyp3a4和cyp2d3的表達量略有增加(分別為2.1倍和1.6倍)，cyp1a1和cyp2b1的表達量顯著增加(分別為4.8倍和6.0倍)。Sun等[21]將小鼠和大鼠暴露于氟康唑后發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，即肝臟中cyp2b和cyp2a家族基因的mRNA水平明顯增高。Hester等[22]同樣發(fā)現(xiàn)，將小鼠暴露于3種三唑類殺菌劑(環(huán)丙唑醇、氟環(huán)唑和丙環(huán)唑)30 d后，小鼠肝臟中多種CYP450酶和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達量增加，并且出現(xiàn)肝細胞肥大、肝中維甲酸含量增加、血清中膽固醇含量減少等毒性效應(yīng)。另外，CYP3A4酶主要負責將雄激素羥基化后失活，對維持體內(nèi)雄激素穩(wěn)定具有重要作用[23]。因此，三唑醇對肝臟中cyp3a4酶的誘導(dǎo)作用可能會導(dǎo)致體內(nèi)雄激素的代謝速率增加，從而影響蜥蜴激素系統(tǒng)的穩(wěn)定。Lv等[24]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，5種常見的三唑類物質(zhì)對CYP3A4的抑制作用與它們的抗雄激素活性具有明顯的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，三唑醇對肝中代謝酶基因的影響可能會導(dǎo)致肝功能異常，進而對機體產(chǎn)生一定的毒害作用。

肝組織病理學(xué)分析進一步揭示了三唑醇對肝組織的損傷，從圖4可以看出，與空白對照組相比，三唑醇暴露組出現(xiàn)明顯的組織空泡，并且在局部區(qū)域出現(xiàn)血竇阻塞現(xiàn)象(紅圈內(nèi))，這說明三唑醇對肝組織具有一定的毒性作用。綜上所述，三唑醇在麗斑麻蜥體內(nèi)的代謝降解和生物蓄積具有明顯的對映選擇性，能夠誘導(dǎo)麗斑麻蜥肝中主要代謝酶的表達量增加，對肝組織具有一定的毒性作用。

圖3 三唑醇暴露(100 mg·kg-1 bw)28 d后雄性麗斑麻蜥肝臟中代謝相關(guān)基因的相對mRNA表達量注：*表示與對照組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 The relative mRNA expression of metabolic genes in male Eremias argus liver after exposure to 100 mg·kg-1 bw triadimenol for 28 dNote: * indicate significant difference compared with control (P<0.05).

圖4 三唑醇暴露(100 mg·kg-1 bw)28 d后雄性麗斑麻蜥肝組織病理學(xué)切片圖(H&E染色)注：ck為空白對照組，TN為三唑醇暴露組。Fig. 4 The micrographs of male Eremias argus liver sections stained with H&E after exposure to 100 mg·kg-1 bw triadimenol for 28 dNote: ck, normal liver section from control group; TN, liver section from exposure group.