劉 妍,鄧堂剛,葉 茂

(湖南大學(xué)生物學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410082)

p21是一種周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)抑制劑,屬于Cip/Kip家族,作為p53下游重要的因子之一,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),p21的功能會(huì)隨著其亞細(xì)胞定位的變化而改變。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí),細(xì)胞核p21與CDKs和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,促使細(xì)胞完成DNA損傷修復(fù),從而維持基因組的穩(wěn)定并抑制腫瘤細(xì)胞增殖。細(xì)胞質(zhì)p21的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞質(zhì)p21在人乳腺癌、肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、白血病等惡性腫瘤組織中高表達(dá),并且與其侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。由于p21在功能上具有雙重性,因此明確p21在不同腫瘤中的生物學(xué)功能及其轉(zhuǎn)位作用機(jī)制,對(duì)靶向p21的腫瘤臨床治療具有重要參考意義。

1 p21的結(jié)構(gòu)

人p21蛋白由CDKN1A基因編碼,該基因定位在6號(hào)染色體短臂上。p21蛋白包含164個(gè)氨基酸,富含精氨酸,相對(duì)分子質(zhì)量約為18 kD。p21蛋白的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示,其N端特異性結(jié)合cyclin/CDKs復(fù)合物。其中,位于17～24位氨基酸的cyclin結(jié)合基序1(Cy1位點(diǎn))主要結(jié)合cyclin D1/CDK4、cyclin E/CDK2 等 cyclin/CDKs復(fù)合物,抑制細(xì)胞周期進(jìn)行。另外,p21的155～157位氨基酸處存在一個(gè)亞RXL基序(Cy2位點(diǎn)),該區(qū)域同樣結(jié)合cyclin/CDKs復(fù)合物,參與細(xì)胞周期的調(diào)控[2]。p21通過Tyr-77(Y77)殘基與CDKs的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)而抑制CDKs催化活性[2]。p21的143～160氨基酸處存在含有8個(gè)氨基酸殘基的PCNA互作蛋白盒(PIP-box)結(jié)構(gòu),可增強(qiáng)p21與PCNA的結(jié)合能力[3]。除此之外,p21的66～74位氨基酸和102～119位氨基酸處各包含一個(gè)核輸出信號(hào)(nuclear export signal,NES),與其核輸出及泛素化降解有關(guān)；140～142位氨基酸處含有一個(gè)細(xì)胞核定位信號(hào)(nuclear localization signal,NLS),負(fù)責(zé)p21的細(xì)胞核定位并實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的功能[4]。

2 p21的生物學(xué)功能及作用機(jī)制

2.1 p21與細(xì)胞周期

2.1.1 細(xì)胞核p21與細(xì)胞周期

真核生物細(xì)胞周期的正常運(yùn)行主要依賴于CDKs和周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinase inhibitors,CKIs)組成的調(diào)控系統(tǒng)。細(xì)胞核p21通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)影響細(xì)胞周期進(jìn)程。在G1期,p21通過抑制cyclin D/CDK4/6復(fù)合物的活性,抑制細(xì)胞周期運(yùn)行,促使細(xì)胞完成DNA損傷修復(fù)。在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中,cyclin E/CDK2復(fù)合物在G1期對(duì)腫瘤抑制蛋白R(shí)b進(jìn)行磷酸化,釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子,促使細(xì)胞進(jìn)入S期,如果G1期DNA發(fā)生損傷,p21則會(huì)抑制CDK2活性,阻止細(xì)胞進(jìn)入S期,誘導(dǎo)細(xì)胞停滯。PCNA作為DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε的輔助因子,是DNA復(fù)制和修復(fù)所必需的,在與PCNA之間的相互作用中,p21可能扮演雙重角色。如果S期發(fā)生DNA損傷,則p21使PCNA失活,從而阻止DNA復(fù)制,促使細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)[5]；同時(shí),p21能夠通過與PCNA結(jié)合的肽段抑制DNA酶1的活性,進(jìn)而抑制PCNA依賴的堿基錯(cuò)配修復(fù)和堿基切除修復(fù)[6]。另外,p21與PCNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Myc,同時(shí)Myc能夠阻斷p21和PCNA之間的結(jié)合,從而抑制p21活性,促進(jìn)DNA復(fù)制,進(jìn)而促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換。核蛋白ICBP90(inverted CCAAT box binding protein of 90 kD)也能參與細(xì)胞周期的調(diào)控,其表達(dá)水平在G1期和G2/M期達(dá)到峰值,在這兩個(gè)時(shí)期中ICBP90通過結(jié)合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(DNA topoisomeraseⅡ-alpha,TopoⅡα)上的CCAAT盒結(jié)構(gòu)域,促進(jìn)細(xì)胞增殖。DNA損傷能促進(jìn)p53轉(zhuǎn)錄激活p21,從而導(dǎo)致ICBP90的轉(zhuǎn)錄水平降低,并促進(jìn)其蛋白質(zhì)降解,引起細(xì)胞停滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。另有研究表明,在染色體組裝過程中,ICBP90與組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶G9a結(jié)合能夠抑制p21的啟動(dòng)子活性[8]。因此,p21與ICBP90之間的平衡也是調(diào)控細(xì)胞周期的重要機(jī)制。此外,因?yàn)镮CBP90還具有E3連接酶的活性[8],所以ICBP90是否能夠介導(dǎo)p21的泛素化降解也值得進(jìn)一步思考。

G2/M期的轉(zhuǎn)換主要與cyclin B/CDK1復(fù)合物有關(guān)。與其他cyclin/CDKs復(fù)合物相比,cyclin B/CDK1復(fù)合物對(duì)p21的親和力較弱,但是當(dāng)DNA受到損傷時(shí),G2/M檢查點(diǎn)被激活,p21與cyclin B/CDK1復(fù)合物結(jié)合,從而阻斷細(xì)胞分裂周期因子25(cell division cycle 25,Cdc25)和周期蛋白依賴性激酶激活激酶(cyclin-dependent-kinase activating kinase,CAK)的活化,阻止G2/M期的轉(zhuǎn)換。有研究提出,p21與PCNA的相互作用也可能導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G2期,推測(cè)是由于p21使PCNA失活,造成S期的DNA損傷,進(jìn)而引起細(xì)胞分裂周期因子2(cell division cycle 2,Cdc2)活性降低,將細(xì)胞停滯在G2期[9]。Cdc20是后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)的底物接頭蛋白。研究發(fā)現(xiàn),早期有絲分裂抑制因子1(early mitotic inhibitor 1,Emi1)可抑制Cdc20與底物結(jié)合,當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí),p21能夠通過下調(diào)Emi1進(jìn)而激活A(yù)PC/CCdc20復(fù)合物,促進(jìn)其對(duì)cyclin A和cyclin B的泛素化降解,引起細(xì)胞周期停滯在G2期[10]。

圖1 p21蛋白的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The schematic diagram of p21

2.1.2 細(xì)胞質(zhì)p21與細(xì)胞周期

細(xì)胞質(zhì)p21也能通過影響CDKs的活性調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換。研究表明,p21的Ser130或Thr145發(fā)生磷酸化后,一方面會(huì)喪失與細(xì)胞核中cyclin/CDKs復(fù)合物結(jié)合的能力,導(dǎo)致其失去阻滯細(xì)胞周期運(yùn)行的功能；另一方面,p21從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí)細(xì)胞質(zhì)cyclin E/CDK2表達(dá)量升高,兩者在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合能夠促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換,但具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[11]。另有研究表明,在一般情況下,細(xì)胞質(zhì)p21能夠抑制細(xì)胞凋亡,但當(dāng)用視磺酸刺激前B淋巴瘤細(xì)胞時(shí),p21表達(dá)上調(diào),且p21與cyclin E/CDK2形成的復(fù)合物水平升高,從而促進(jìn)前B淋巴瘤細(xì)胞的凋亡[12]。以上研究表明,在細(xì)胞質(zhì)中p21仍然會(huì)結(jié)合cyclin/CDKs復(fù)合物,調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行。另外,Thr145磷酸化的p21還可通過激活cyclin D1/CDK4復(fù)合物介導(dǎo)G1/S期的轉(zhuǎn)換,同時(shí)p21對(duì)PCNA的抑制能力減弱可促進(jìn)DNA合成及S期運(yùn)行,最終促使細(xì)胞增殖[13]。

2.2 p21與細(xì)胞凋亡

2.2.1 細(xì)胞核p21與細(xì)胞凋亡

除參與調(diào)控細(xì)胞周期外,p21還是細(xì)胞凋亡重要的調(diào)控因子。作為p53重要的下游靶標(biāo)分子之一,p21可以響應(yīng)p53對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。當(dāng)DNA受到輕度損傷時(shí),p21在p53存在的情況下能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G2期,促使細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù),進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡；如果DNA損傷嚴(yán)重,p53可直接誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

除與p53有關(guān)外,p21也能夠響應(yīng)細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 E2F、Myc、核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activators of transcription,STAT)等的調(diào)控,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p21對(duì)Rb磷酸化后能夠通過招募染色體重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF(yeast switch in mating type/sucrose non fermentation)抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而阻斷DNA復(fù)制,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。Myc可通過與轉(zhuǎn)錄抑制因子ZMIZ-1結(jié)合抑制p21的功能,同時(shí)Myc還能招募轉(zhuǎn)錄因子激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4 (activating enhancer bind ing protein 4,AP4)和賴氨酸特異性去甲基化酶5B(lysine-specific demethylase 5B,KDM5B),阻斷Myc與p21啟動(dòng)子結(jié)合,抑制p21轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外,Myc也可通過miR17-92對(duì)p21的mRNA進(jìn)行剪切,抑制p21的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),p21與NF-κB和STAT結(jié)合能夠抑制B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣IL-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular FADD-like IL-1β-converting enzyme-inhibitory protein,c-FLIP)、Bcl-XL(B cell lymphoma-XL)和X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)等抗凋亡蛋白的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。p21的上調(diào)可促進(jìn)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)上調(diào),從而引起細(xì)胞中Bax與Bcl-2的蛋白質(zhì)比例發(fā)生變化,最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。

2.2.2 細(xì)胞質(zhì)p21與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞質(zhì)p21能夠抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞質(zhì)p21主要通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白及一些凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的活性實(shí)現(xiàn)其抗凋亡的功能,這些因子包括cyclin/CDKs、胱天蛋白酶 3(caspase-3)、caspase-8、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)、致癌蛋白 Ras(rat sarcoma)及應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)等。研究表明,細(xì)胞質(zhì)p21促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并且能夠增強(qiáng)其耐藥性；免疫組化結(jié)果顯示,細(xì)胞質(zhì)p21的高表達(dá)伴隨著細(xì)胞質(zhì)cyclin B1的表達(dá)上調(diào),同時(shí)乳腺癌患者生存期縮短,由此推測(cè)細(xì)胞質(zhì)p21可能通過cyclin B1調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞凋亡,但是具體機(jī)制還未明確[9]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),caspase-3對(duì)p21進(jìn)行切割降解,減弱p21對(duì)cyclin A/CDK2復(fù)合物活性的抑制,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,p21與caspase-3的相互作用還可阻止由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。p21過表達(dá)能夠阻斷死亡受體4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的caspase-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。蛋白激酶B(AKT)對(duì)p21的Thr145磷酸化后促使其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,隨后p21與ASK1形成復(fù)合物,抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MAPKK4)和MAPKK6的活化,進(jìn)而分別抑制下游激酶SPAK和p38的活性,最終抑制細(xì)胞凋亡[20]。當(dāng)細(xì)胞受輻射刺激時(shí),腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路被激活,而p21能通過抑制該信號(hào)通路下游的caspase-3和caspase-9的活化,抑制由輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Ras通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxy kinase,PI3K)和MAPKK途徑使p21磷酸化,并介導(dǎo)其定位在細(xì)胞質(zhì),隨后與Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)結(jié)合,抑制ROCK/LIMIK/coflin途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]。

在單核細(xì)胞中人們也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)p21的高表達(dá),其通過抑制細(xì)胞凋亡阻止細(xì)胞終端分化。在外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中,p21從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位,可增強(qiáng)PBMCs對(duì)多種細(xì)胞因子刺激的抵抗能力；生化分析結(jié)果顯示,細(xì)胞質(zhì)p21能夠結(jié)合并抑制ASK1的活性,同時(shí)抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activation protein kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[22]。在滋養(yǎng)層巨細(xì)胞分化過程中,p21被AKT磷酸化,G1期和S期的細(xì)胞質(zhì)p21蛋白水平均升高,促進(jìn)細(xì)胞存活[23]；另外,當(dāng)人胚胎成纖維細(xì)胞的DNA發(fā)生輕度損傷時(shí),胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)能夠?qū)21進(jìn)行磷酸化,導(dǎo)致其細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位,從而抑制細(xì)胞凋亡[24],上述信息提示細(xì)胞質(zhì)p21對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制與其磷酸化修飾緊密相關(guān)。

3 p21細(xì)胞質(zhì)定位的調(diào)控機(jī)制

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾能夠改變其在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,從而導(dǎo)致其功能發(fā)生改變。p21蛋白含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),目前發(fā)現(xiàn)p21的NES和NLS附近有5個(gè)磷酸化位點(diǎn),均與其核質(zhì)穿梭有關(guān)。當(dāng)磷酸化的AKT對(duì)p21的NLS附近的Thr145進(jìn)行磷酸化時(shí),p21穩(wěn)定性提高,并且可使其由細(xì)胞核加速轉(zhuǎn)向細(xì)胞質(zhì),同時(shí)p21也由抑癌因子變?yōu)榇侔┮蜃覽25]。由于亞細(xì)胞定位的不同會(huì)使p21具有不同的功能,因此闡明p21在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)位機(jī)制對(duì)研究p21的功能具有重要意義。p21的轉(zhuǎn)位不僅與多種調(diào)控因素有關(guān),還與不同種類的細(xì)胞系有關(guān)。目前研究較為清楚的是ERK2和AKT對(duì)p21的磷酸化介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。

當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)刺激細(xì)胞時(shí),ERK2被持續(xù)激活,并對(duì)p21的Thr57和Ser130進(jìn)行磷酸化,促進(jìn)p21由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì),同時(shí)促進(jìn)S期激活相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)介導(dǎo)的p21的泛素-蛋白酶體途徑降解[26]。AKT能夠直接對(duì)p21的Thr145進(jìn)行磷酸化,而且Thr145靠近p21的NLS,其磷酸化修飾可阻止p21與核輸入蛋白結(jié)合,從而將p21滯留在細(xì)胞質(zhì)中；另外,AKT還可通過激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),間接對(duì)p21的Ser146進(jìn)行磷酸化,從而將p21阻滯在細(xì)胞質(zhì)中,并且延長(zhǎng)了p21的半衰期[25]。p21中Thr145和Ser146的磷酸化可阻礙p21與PCNA的結(jié)合,而游離的PCNA會(huì)激活DNA聚合酶,促進(jìn)S期運(yùn)行,最終導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)和堿基切除修復(fù)缺陷[26],這可能是細(xì)胞質(zhì)p21導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖的一種機(jī)制。除介導(dǎo)p21的磷酸化外,AKT還能通過抑制糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)的活性阻止GSK3對(duì)p21的Thr57磷酸化,該位點(diǎn)的去磷酸化可減弱p21與CDKs的結(jié)合,進(jìn)而減弱由CDKs介導(dǎo)的p21降解,所以AKT也可能通過GSK3延長(zhǎng)p21的半衰期,并促進(jìn)其細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位[27],但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

研究發(fā)現(xiàn),一些激酶也可通過AKT調(diào)控p21的細(xì)胞質(zhì)定位,如NF-κB抑制激酶β(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta,IKKβ)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)及熱激蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)等。IKKβ參與了p21在細(xì)胞質(zhì)中的積累,一方面,當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),IKKβ被腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1(interleukin-1,IL-1)磷酸化激活,釋放 NF-κB,促進(jìn)p21的轉(zhuǎn)錄；另一方面,IKKβ促進(jìn)AKT的Ser473磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)p21的磷酸化,將其阻滯在細(xì)胞質(zhì)中,而p21在細(xì)胞質(zhì)中的積累可使乳腺癌細(xì)胞獲得較強(qiáng)的耐藥性,最終促進(jìn)癌細(xì)胞存活[28]。Winters等[29]經(jīng)過連續(xù)9年對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,HER-2能夠誘導(dǎo)p21的細(xì)胞質(zhì)定位,并能夠抵抗細(xì)胞凋亡,而定位在細(xì)胞質(zhì)中的p21可減弱對(duì)細(xì)胞核中細(xì)胞周期蛋白的抑制,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。研究人員推測(cè)可能是HER-2通過磷酸化激活了AKT,AKT進(jìn)一步對(duì)p21的Thr145磷酸化,從而使p21由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位,一旦抑制AKT的激酶活性,p21則重新定位到細(xì)胞核,并且其促增殖活性降低[30]。HSP27也可通過對(duì)AKT進(jìn)行磷酸化,促進(jìn)p21向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位[31]。以上3種蛋白激酶都是通過AKT間接促進(jìn)p21的細(xì)胞質(zhì)定位,但是這三者是否可通過直接催化p21的磷酸化介導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)定位還有待深入研究。綜上所述可知,對(duì)AKT進(jìn)行人為干擾是調(diào)節(jié)p21的重要手段之一,AKT抑制劑的篩選和開發(fā)是重要的研究方向并具有重要的腫瘤臨床治療意義。最先開發(fā)出的AKT抑制劑是以 ipatasertib、Nl-71-101、GSK690693等為代表的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,目前該類抑制劑家族已有10余種[32]。研究發(fā)現(xiàn),ipatasertib在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中對(duì)實(shí)體瘤患者具有較好的療效以及安全性[33]；在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,與慰安劑相比,ipatasertib與紫杉醇連用能夠延長(zhǎng)三陰性乳腺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期[34],可見ipatasertib在腫瘤的臨床治療上具有良好應(yīng)用前景。但是ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)AKT同工酶無(wú)選擇性,對(duì)于與AKT結(jié)構(gòu)相似的激酶如PKA、ROCK等的選擇性差,因此出現(xiàn)了AKT的變構(gòu)抑制劑。AKT變構(gòu)抑制劑主要包括5,6二苯吡嗪 2(1H)、MK-2206、SR13668等,有近 20 種。該類抑制劑具有高選擇性和相對(duì)較低的毒性,其中,MK-2206與吉非替尼的聯(lián)合使用已投入非小細(xì)胞肺癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)[32]；同時(shí)MK-2206也已經(jīng)進(jìn)入晚期乳腺癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)[35]。另外,還有一些不可逆轉(zhuǎn)的AKT抑制劑的開發(fā),例如ll-AF101等。目前,該類抑制劑的家族成員較少,是值得深入研究的方向[32]?？偟膩?lái)講,盡管有很多AKT抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn),但是應(yīng)用于腫瘤臨床治療的很少,且單獨(dú)使用效果不佳,通常需要與一些化療藥物協(xié)同使用。

此外,p21與某些蛋白質(zhì)的物理結(jié)合也可能導(dǎo)致其定位改變。有研究發(fā)現(xiàn),阿霉素(DOX)處理人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1后,促進(jìn)了p65與p21啟動(dòng)子的結(jié)合,同時(shí)能夠促進(jìn)p21由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì),轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)后的p21與caspase-3前體(pro-caspase 3)結(jié)合,阻止了p21重新向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,同時(shí)還增加了c-IAP1、Bcl-2等抗凋亡因子的轉(zhuǎn)錄水平,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[36]。除以上機(jī)制外,DNA損傷后,核苷酸還原酶小亞基p53R2上調(diào),為腫瘤細(xì)胞提供dNTP,促使其進(jìn)行DNA損傷修復(fù),同時(shí)還伴隨著細(xì)胞質(zhì)p21的上調(diào),進(jìn)而激活CDK4/6,隨后引起Rb對(duì)E2F的激活,促進(jìn)細(xì)胞增殖[37]。在大多數(shù)癌癥中p53發(fā)生突變,p53R2對(duì)細(xì)胞質(zhì)p21的上調(diào)是否依賴于突變的p53值得深入探究。

4 p21與腫瘤

4.1 細(xì)胞核p21與腫瘤

4.1.1 白血病

白血病是造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病,髓系分化障礙是其主要的發(fā)病機(jī)制之一。其根據(jù)細(xì)胞的分化程度可分為急、慢性白血病。通過對(duì)白血病患者的臨床樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),p21在白血病細(xì)胞中呈低表達(dá),其低表達(dá)能夠?qū)е掳籽〖?xì)胞分化受阻；采用一定治療手段后,p21的表達(dá)水平升高,這些信息提示p21可作為白血病化療療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)[38]。視磺酸是治療白血病的主要化療藥物之一,其主要是通過誘導(dǎo)p21轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化,最終緩解急性早幼粒細(xì)胞白血病[39]。因此,p21能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞分化,進(jìn)而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。

近年來(lái)人們?cè)诎籽〖?xì)胞中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些p21的上游調(diào)控因子,如NF-κB和克魯佩爾樣因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)。NF-κB 能夠直接激活p21的表達(dá),從而響應(yīng)骨髓白血病細(xì)胞中的DNA損傷,進(jìn)而控制DNA損傷誘導(dǎo)的髓樣分化[40]。KLF2是KLF家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子的成員,在白血病細(xì)胞Jurkat中,KLF2能夠通過上調(diào)p21的表達(dá)抑制Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)[41]。因此,NF-κB和KLF2有望作為白血病治療的分子靶標(biāo)。

4.1.2 黑色素瘤

黑色素瘤是皮膚癌中最為惡性的腫瘤。Vidal等[42]的研究發(fā)現(xiàn),p21在不同種類的黑色素瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異很大且功能也具有雙重性。在黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-110中,p21能阻止由p53誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡,促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞存活[43]；而p21能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞A375和WM1976的增殖[44]。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是表觀遺傳轉(zhuǎn)錄抑制因子,研究發(fā)現(xiàn)其在正常的黑色素細(xì)胞中不表達(dá),但是在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)升高,且可通過抑制p21的活性抑制黑色素瘤細(xì)胞的衰老和凋亡[45]。

目前臨床上主要采用手術(shù)切除和術(shù)后放療的方式治療黑色素瘤,但是腫瘤?？狗暖?。二甲雙胍是治療糖尿病的常用藥,近年來(lái)有研究將二甲雙胍用于黑色素瘤的治療,且治療效果顯著,在機(jī)制上二甲雙胍可以通過作用于腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)促進(jìn)p53的磷酸化,從而間接促進(jìn)p21的上調(diào),最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡[46]?？梢?p21可作為黑色素治療的潛在靶點(diǎn),同時(shí)二甲雙胍和雙胍衍生化合物類藥物可能是治療黑素瘤的新手段。

4.1.3 肺癌

最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告表明,2018年全球肺癌的死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%,是癌癥死亡的主要原因[47]。目前針對(duì)肺癌的主要治療手段是手術(shù)切除和化療,但是,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)對(duì)化療相對(duì)不敏感,因此篩選肺癌分子標(biāo)志物具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),p21的表達(dá)與NSCLC的組織分化程度顯著相關(guān),p21免疫反應(yīng)常見于病灶,而且p21表達(dá)不依賴于p53,所有p53+/p21-的NSCLC患者在進(jìn)行手術(shù)切除后1年內(nèi)死亡,說明p21可作為非小細(xì)胞肺癌獨(dú)立的預(yù)后因素,是潛在的重要臨床標(biāo)志物[48]。在肺癌中,p21受到過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)配體的刺激而表達(dá)水平升高,進(jìn)而抑制人肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[49]。未來(lái)可針對(duì)肺癌中p21的正調(diào)控因子開發(fā)激活劑,以提高p21在肺癌中的表達(dá)水平,從而抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。

4.1.4 結(jié)直腸癌

Bukholm等[50]發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性結(jié)直腸癌中p21的表達(dá)偏低,而且p21的缺失與高死亡率密切相關(guān),這提示在臨床上p21的表達(dá)水平可作為判斷原發(fā)性結(jié)直腸癌是否具有轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。Zirbes等[51]連續(xù)6年對(duì)294名結(jié)直腸癌患者的腫瘤樣本進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)p21表達(dá)呈陽(yáng)性的患者存活率更高,說明p21可能會(huì)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

4.1.5 前列腺癌

前列腺癌是美國(guó)男性癌癥中的第二大癌癥[47],目前臨床上主要采用水飛薊素(silibinin)進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn),silibinin能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中p21和p27的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[52]。另外,槲皮素也被應(yīng)用于前列腺癌的治療,在槲皮素的作用下,前列腺癌細(xì)胞PC-3中的p21表達(dá)升高,并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[53]。上述研究表明,細(xì)胞核p21在前列腺癌中能夠響應(yīng)化療藥物處理引起的細(xì)胞凋亡,因此明確這些藥物處理后,p21在前列腺癌中具體的上下游調(diào)控機(jī)制,將有助于針對(duì)這類藥物開發(fā)合適的分子靶標(biāo),增強(qiáng)藥物靶向性,提高前列腺癌的治療效率。

4.1.6 膀胱癌

膀胱癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。目前,臨床上采用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)進(jìn)行輔助治療。在卡介苗治療過程中,細(xì)胞核中的p21和p27表達(dá)升高,阻滯細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn),最終引起細(xì)胞凋亡,提示p21和p27在細(xì)胞核中的表達(dá)水平可能與卡介苗治療效果呈正相關(guān)[54]。因此,p21和p27的共表達(dá)量與卡介苗最佳治療效果的關(guān)系可深入研究。

4.2 細(xì)胞質(zhì)p21與腫瘤

4.2.1 乳腺癌

細(xì)胞質(zhì)p21在乳腺癌細(xì)胞中很常見。定位在細(xì)胞質(zhì)中的p21能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并且能夠增強(qiáng)其耐藥性。Caffo等[55]長(zhǎng)期跟蹤觀察了261例乳腺癌患者的p21免疫原性,發(fā)現(xiàn)p21的過表達(dá)與大腫瘤大小、陽(yáng)性淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)和高有絲分裂相關(guān),并且與患者短生存期有關(guān),表明p21在細(xì)胞質(zhì)中的定位與乳腺癌的惡性增殖有重要聯(lián)系,可以作為乳腺癌的預(yù)后靶標(biāo)。但是,由于細(xì)胞質(zhì)中p21的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確,所以到目前為止,并沒有針對(duì)細(xì)胞質(zhì)p21的藥物開發(fā)。需要指出的是,現(xiàn)階段已有針對(duì)caspase-3的降解而間接抑制p21活性的促凋亡藥物的開發(fā),并有望投入臨床應(yīng)用[56]。此外,有研究報(bào)道,細(xì)胞質(zhì)中p21的表達(dá)與乳腺癌標(biāo)志物HER-2的過表達(dá)密切相關(guān),細(xì)胞質(zhì)p21的表達(dá)與其Thr145磷酸化呈正相關(guān),同時(shí)也與HER-2及磷酸化的AKT高度相關(guān)[29]。由此可見,在針對(duì)乳腺癌的治療過程中,可使用AKT特異性抑制劑,以抑制其介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)位,同時(shí)還可以直接針對(duì)細(xì)胞質(zhì)p21及HER-2開發(fā)抑制劑,以達(dá)到抑制或減緩腫瘤增殖以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的治療目的。

4.2.2 卵巢癌

研究發(fā)現(xiàn),p21可能是卵巢癌臨床治療中一個(gè)重要的分子靶標(biāo)。在高級(jí)別漿液性卵巢癌細(xì)胞(high-grade serous ovarian cancer cells,HGSCs)中,突變的p53能夠介導(dǎo)癌蛋白PAX8的促增殖作用,反過來(lái),PAX8能夠正向調(diào)控p53的表達(dá),從而進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄激活HGSCs細(xì)胞質(zhì)中p21的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖[57]。

卵巢細(xì)胞癌變過程中,細(xì)胞質(zhì)p21的表達(dá)水平升高,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)促進(jìn)卵巢癌復(fù)發(fā)[58]。與卵巢癌細(xì)胞OV2008相比,卵巢癌細(xì)胞C13中細(xì)胞質(zhì)p21的表達(dá)水平更高,并且低劑量的順鉑能夠誘導(dǎo)OV2008細(xì)胞中的p21由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移?？傊?細(xì)胞質(zhì)p21可以作為治療耐藥性卵巢癌的潛在靶標(biāo)。

4.2.3 肝癌

部分人類肝癌細(xì)胞表達(dá)p21,而且p21的高表達(dá)與患者短生存期有關(guān),敲減p21則能延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。在慢性肝損傷期間,p21是肝臟祖細(xì)胞活化必需的,但p21對(duì)肝再生的影響取決于細(xì)胞內(nèi)p21的表達(dá)水平,也取決于其在腫瘤微環(huán)境中的作用。Shiraki等[59]的研究發(fā)現(xiàn),在多種肝癌細(xì)胞中,p21主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,并且細(xì)胞質(zhì)p21的表達(dá)在分化不完全的肝癌細(xì)胞中比分化良好的細(xì)胞中高,由此推測(cè)細(xì)胞質(zhì)p21能夠作為肝癌的預(yù)后靶標(biāo)。

表1 p21在不同腫瘤細(xì)胞中的定位及其生物學(xué)功能Table 1 Location and biological functions of p21 in different tumor cells

4.2.4 睪丸癌

睪丸癌是泌尿外科中惡性程度很高的腫瘤之一,并且能夠?qū)熕幬锂a(chǎn)生較強(qiáng)耐受性。研究發(fā)現(xiàn),在睪丸胚胎癌中,細(xì)胞質(zhì)p21表達(dá)升高,隨后通過抑制CDK2活性使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)順鉑的耐藥性,并且這種耐藥機(jī)制與Oct4/miR-106b/p21調(diào)控途徑有關(guān)[60]。細(xì)胞質(zhì)p21與睪丸癌的惡性程度呈正相關(guān),可能是睪丸癌難以治愈的原因之一,未來(lái)可針細(xì)胞質(zhì)p21開發(fā)治療睪丸癌的靶向藥物。

5 結(jié)語(yǔ)

p21對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控具有重要意義,且同時(shí)參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老以及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種重要的生理過程,對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。多項(xiàng)研究表明,p21既可作為腫瘤抑制因子,也是促癌因子。由于亞細(xì)胞定位及腫瘤細(xì)胞種類的不同,p21的功能也不同。表1總結(jié)了p21在常見腫瘤中的定位及其生物學(xué)功能。當(dāng)p21定位于細(xì)胞核時(shí),能夠抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；當(dāng)其定位在細(xì)胞質(zhì)時(shí),能夠促進(jìn)乳腺癌、頭頸癌、前列腺癌、睪丸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性。因此,充分了解p21的生物學(xué)功能及其轉(zhuǎn)位調(diào)控機(jī)制能夠?yàn)槟[瘤靶向性的治療提供重要的策略和方向。