張妍薇,鄭 皖,3,楊人貴,陳靜芳,向曉婧,陳繼華*

(1.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院,中國湖南長沙410078；2.長沙市疾病預(yù)防控制中心,中國湖南長沙410002；3.遂寧市中心醫(yī)院,中國四川遂寧629099；4.長沙市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,中國湖南長沙410018)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人民生活節(jié)奏加快,以心血管疾病、癌癥、慢性呼吸系統(tǒng)疾病和糖尿病為主的慢性病取代了傳染病的主要地位,成為了加重居民經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),降低生活質(zhì)量的重要公共衛(wèi)生問題[1]。

大量研究表明,慢性病的發(fā)生發(fā)展與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過量緊密相關(guān)[2～3]。ROS是含氧化學(xué)反應(yīng)分子,包括超氧陰離子(O2-·)、羥基自由基(·OH)及過氧化氫(H2O2)等。適量的ROS具有積極作用,包括參與殺死入侵的病原體、傷口愈合和修復(fù)過程。當(dāng)機(jī)體受到紫外線、環(huán)境毒物、高氧、低氧等外界刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS,過量的ROS在不同的器官中如若不能被有效清除,則會(huì)造成積聚,此時(shí)高濃度的ROS會(huì)通過DNA損傷、脂質(zhì)過氧化或蛋白質(zhì)破壞等方式,對(duì)細(xì)胞造成持續(xù)性的破壞,引起氧化應(yīng)激損傷,造成機(jī)體生理功能紊亂,從而導(dǎo)致疾病[4]。研究報(bào)道,在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中,過量的ROS可抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性,引起炎癥和細(xì)胞死亡,并對(duì)脂肪變性產(chǎn)生重要作用[5]。

非瑟酮(3,3′,4′,7-四羥基黃酮,fisetin)是一種廣泛存在于蔬菜水果中的黃酮類化合物。研究表明,fisetin具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管等多種生物學(xué)作用[6]。Seo等[7]發(fā)現(xiàn),fisetin可以通過誘導(dǎo)PI3K/AKT/Nrf2介導(dǎo)的血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá),抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中TNF-α誘導(dǎo)的炎癥作用和H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。Sakai等[8]報(bào)道,fisetin可通過上調(diào)Nrf2介導(dǎo)的II期抗氧化酶的表達(dá)水平,阻斷核因子κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)介導(dǎo)的 ROS 產(chǎn)生,繼而抑制破骨細(xì)胞(osteoclasts,OCL)分化。然而,fisetin對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用及其機(jī)制尚不清楚。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[9]。大量關(guān)于Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)通路的研究認(rèn)為,在正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1相結(jié)合,經(jīng)泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制,使Nrf2處于非游離及不斷降解的非活性狀態(tài)；在氧化應(yīng)激條件下,Keap1對(duì)Nrf2的泛素化和降解能力減弱,Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),與ARE結(jié)合后可誘導(dǎo)下游二相解毒酶及抗氧化蛋白如醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)、HO-1等的表達(dá),從而清除ROS,發(fā)揮其抗氧化作用[10]。已有研究表明,Nrf2所介導(dǎo)的細(xì)胞防御系統(tǒng)對(duì)氧化應(yīng)激所誘發(fā)的疾病如癌癥[11]、糖尿病[12～13]、呼吸系統(tǒng)疾病[14]、慢性炎癥[15～16]、心血管疾病[17～18]以及神經(jīng)退行性疾病[19～20]等具有保護(hù)性作用。因此,Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)的激活是預(yù)防和治療這些疾病的有效策略。

本研究希望通過觀察fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)ROS的影響,探究fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用及其對(duì)ROS的清除效果；同時(shí)根據(jù)fisetin對(duì)Nrf2、Keap1、Ⅱ相酶表達(dá)水平的調(diào)控作用,探討fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

人肝癌細(xì)胞HepG2來自中南大學(xué)腫瘤研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與主要試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder公司,德國)；超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡AE2000(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；垂直電泳槽BE-240及轉(zhuǎn)膜儀BE-320(BioCraft公司,日本)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

Fisetin(Selleck公司,美國)；DMSO(Sigma公司,美國)；RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco公司,美國)；胎牛血清(Gibco公司,美國)；MTT試劑盒(Sigma公司,美國)；活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ROS熒光探針-DHE(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液(強(qiáng))(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 3000試劑(Thermo Fisher Scientific公司,美國)；雙標(biāo)記慢病毒載體GV248(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；胰酶(Genview公司,美國)；sh-Con質(zhì)粒(陰性對(duì)照,NC)、sh-Nrf2質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；PVDF 膜(Immobilon-P 公司,美國)；α-tubulin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；Nrf2抗體(Abcam公司,英國)；Keap1抗體、HO-1抗體、NQO1抗體、GCLC抗體(Santa Cruz公司,美國)；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control)、溶劑對(duì)照組(solvent control,培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為1‰的DMSO)、H2O2模型組(H2O2model group,培養(yǎng)基中加入 500 μmol/L H2O2處理 30 min)、fisetin干預(yù)組(培養(yǎng)基中先分別加入 10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L fisetin 處理 5.5 h,再加入 500 μmol/L H2O2處理30 min)、fisetin單獨(dú)處理組(培養(yǎng)基中加入30 μmol/L fisetin處理6 h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Nrf2敲低細(xì)胞系的構(gòu)建

委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)3條以Nrf2為靶點(diǎn)的shRNAs,依據(jù)該公司提供的定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出相較于其他兩條敲低效率高(92.1%)的shRNA(ccggacTGACAGAAGTTGACAATTActcgagTAATTGTCAACTTCTGTCAgttttttg),認(rèn)為其為有效靶點(diǎn),并將其克隆到雙標(biāo)記慢病毒載體GV248中。用Lipofectamine 3000將sh-Con(陰性對(duì)照)、sh-Nrf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中,兩天后加入嘌呤霉素,殺死未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。于湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心采用流式細(xì)胞儀分選帶有綠色熒光的強(qiáng)陽性細(xì)胞。提取所分選的細(xì)胞蛋白質(zhì),通過Western-blot檢測Nrf2的表達(dá)情況,從而鑒定Nrf2敲低細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細(xì)胞,隨后換液加入MTT試劑(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。吸棄廢液,每孔加入150 μL DMSO使紫色結(jié)晶完全溶解,之后用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率r=(ODs/ODd)×100%,式中,ODs與ODd分別為處理組與對(duì)照組的吸光度值。

1.3.5 ROS檢測

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細(xì)胞,隨后換液,加入2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFHDA)(10 μmol/L)反應(yīng) 30 min。PBS 清洗一遍后,使用488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長,檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

1.3.6 Western-blot檢測

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,以1×106個(gè)/碟接種于6 cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h,期間按1.3.2分組方法處理細(xì)胞,隨后每碟加入200 μL RIPA裂解液,用刮刀刮下細(xì)胞,充分裂解后離心提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),并用BCA法定量。根據(jù)定量結(jié)果統(tǒng)一濃度至10 μg/μL 后,加入 5× loading buffer混勻,100℃加熱10 min。用回收的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白質(zhì)上樣量為30～50 μg,電泳參數(shù)設(shè)為恒壓80 V、2 h。切取含有目的蛋白的膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,參數(shù)設(shè)為恒壓80 V、1 h 30 min。5%脫脂牛奶封閉1 h后用1×TBST 洗滌 3 次；加入 Nrf2(1∶2 500)、Keap1(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)、GCLC(1∶1 000)、GCLM(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)抗體 4 ℃過夜；1×TBST洗滌3次；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h；1×TBST洗滌3次；ECL化學(xué)發(fā)光液顯色；采用Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察和拍照,并用Tanon Gel Image System軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以Dunnettt檢驗(yàn)比較各組間均數(shù)的差異,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Fisetin和H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用不同濃度的fisetin處理細(xì)胞24 h時(shí),隨著fisetin濃度的增加,細(xì)胞存活率下降；當(dāng)fisetin濃度為45.98 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率為50%[9]。因此,本次實(shí)驗(yàn)選用的fisetin 濃度為 10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L。為了探究fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,我們檢測了不同處理組細(xì)胞的存活率大小。結(jié)果如表1所示,與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組的細(xì)胞存活率無明顯差異(100%&99.66%±0.34%,P＞0.05),fisetin單獨(dú)處理組的細(xì)胞存活率也無明顯差異(100%&98.67%±0.86%,P＞0.05),但H2O2模型組的細(xì)胞存活率顯著下降(100%&48.72%±1.19%,P＜0.05)；與 H2O2模型組相比,fisetin干預(yù)組的細(xì)胞存活率顯著上升(48.72%±1.19%&53.71%±1.51%,54.84%±1.59%,51.28%±0.20%,P＜0.05)。以上結(jié)果說明,在一定濃度范圍內(nèi),fisetin能夠?qū)2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)性作用。

2.2 Fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

為了進(jìn)一步探究fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Hep-G2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,我們選用DCFHDA探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,其進(jìn)入細(xì)胞后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的 7′-二氯熒光素(7′-dichlorofluorescein,DCF)。因此,檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。圖1結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,H2O2模型組、fisetin單獨(dú)處理組中ROS的水平分別上升了約0.8、0.3 倍(P＜0.05)；與 H2O2模型組相比,fisetin干預(yù)組中ROS的水平分別下降了約7.1%、23.4%、30.5%(P＜0.05)。以上結(jié)果說明,在一定濃度范圍內(nèi),fisetin能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

表1 Fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of fisetin on the survival rate of HepG2 cells induced by H2O2±s,n=3)

表1 Fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of fisetin on the survival rate of HepG2 cells induced by H2O2±s,n=3)

注:*表示與空白對(duì)照組相比P＜0.05,#表示與H2O2模型組相比P＜0.05,圖1～3的統(tǒng)計(jì)分析相同。Notes:*P＜0.05,compared with the control group；#P＜0.05,compared with the H2O2model group.These are the same in the following Figs.1～3.

images/BZ_14_1282_568_2201_622.pngControl Solvent control H2O2model group Fisetin(10 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(20 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(30 μmol/L)+H2O2(500 μmol/L)Fisetin(30 μmol/L)100 99.66±0.34 48.72±1.19*53.71±1.51#54.84±1.59#51.28±0.20#98.67±0.86

圖1 Fisetin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.1 Effect of fisetin on ROS in HepG2 cells induced by H2O2

2.3 Fisetin對(duì)Ⅱ相酶表達(dá)水平的影響

HO-1、GCLC、GCLM、NQO1是Ⅱ相抗氧化酶,能夠清除ROS,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。為了探究fisetin對(duì)Ⅱ相抗氧化酶表達(dá)水平的影響,本研究檢測了 HO-1、GCLC、GCLM、NQO1蛋白的表達(dá)。圖2結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,用fisetin單獨(dú)處理后HO-1蛋白的表達(dá)水平顯著增加了約2.1倍(P＜0.05)；與H2O2模型組相比,fisetin干預(yù)組中HO-1蛋白的表達(dá)水平分別增加了約2.3、2.0、1.6 倍(P＜0.05)。然而,GCLC、GCLM、NQO1的表達(dá)水平在各組中并無明顯差異(P＞0.05)。

圖2 Fisetin對(duì)Ⅱ相酶表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of fisetin on phaseⅡenzyme expression

2.4 Fisetin對(duì)Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)的影響

Nrf2是 HO-1、GCLC、GCLM、NQO1的上游轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。而Keap1被廣泛認(rèn)為是Nrf2激活的中樞負(fù)調(diào)節(jié)劑。為了探討fisetin是否通過影響Nrf2/Keap1信號(hào)通路來發(fā)揮其抗氧化保護(hù)作用,我們通過Western-blot進(jìn)一步檢測了Nrf2、Keap1蛋白的表達(dá)。圖3結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,H2O2模型組和fisetin單獨(dú)處理組中Keap1蛋白的表達(dá)水平分別下降了約16.6%、59.7%(P＜0.05),且fisetin單獨(dú)處理組中Nrf2蛋白的表達(dá)水平增加了約1.5倍(P＜0.05)；與H2O2模型組相比,干預(yù)組在20 μmol/L、30 μmol/L fisetin 處理時(shí)其 Nrf2 水平分別增加了 0.8、1.0倍(P＜0.05),在10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L fisetin處理時(shí)其Keap1水平分別下降了21.2%、23.6%、43.9%(P＜0.05)。以上結(jié)果說明,fisetin能夠增加Nrf2蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)降低Keap1蛋白的表達(dá)水平。

2.5 Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用

上述結(jié)果顯示fisetin對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用可能是通過增加Nrf2蛋白,激活Nrf2-ARE通路,誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)等途徑發(fā)揮的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用,我們通過轉(zhuǎn)染sh-Nrf2質(zhì)粒,敲低了HepG2細(xì)胞中Nrf2的表達(dá),并對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量進(jìn)行了測定。

圖3 Fisetin對(duì)Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of fisetin on Nrf2 and Keap1 expression

圖4A、4B結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組(sh-Con)相比,sh-Nrf2組中Nrf2蛋白的表達(dá)水平明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而Keap1蛋白的表達(dá)水平變化不顯著,這說明Nrf2低表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4C結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞系的熒光值在對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；H2O2模型組與對(duì)照組相比,兩種細(xì)胞系中的熒光強(qiáng)度均顯著增加(P＜0.01),其中sh-Con細(xì)胞系的熒光值增加了約0.8倍,sh-Nrf2細(xì)胞系的熒光值增加了約1.9倍；在H2O2模型組中,sh-Nrf2細(xì)胞系的熒光值顯著高于sh-Con細(xì)胞系的熒光值,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與H2O2模型組相比,20 μmol/L fisetin干預(yù)組中兩種細(xì)胞系的熒光值均顯著降低(P＜0.01),其中sh-Con細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度降低了24.2%,sh-Nrf2細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度僅降低了11.8%。這些結(jié)果說明,Nrf2缺失時(shí)H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS水平增加；Nrf2在fisetin清除細(xì)胞內(nèi)ROS的過程中起到關(guān)鍵性作用。

3 討論

慢性病具有難以治愈的特征,它不僅會(huì)降低人們的勞動(dòng)能力與生活質(zhì)量,還會(huì)加重家庭與社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)報(bào)道,ROS與超過200種臨床疾病的早期發(fā)生相關(guān),心血管疾病、癌癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝等重大疾病均涵括其中[2]。因此,尋找一種能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平的物質(zhì),對(duì)疾病的預(yù)防具有重要意義。

圖4 Nrf2在fisetin清除ROS過程中的作用(A～B)sh-Nrf2細(xì)胞系中Nrf2蛋白的表達(dá):(C)Fisetin對(duì)sh-Nrf2細(xì)胞中ROS的清除效果。**表示與空白對(duì)照組相比,P＜0.01；#表示與H2O2模型組相比,P＜0.01；&表示sh-Nrf2細(xì)胞H2O2模型組與sh-Con細(xì)胞H2O2模型組相比,P＜0.01；△表示sh-Nrf2細(xì)胞fisetin處理組與sh-Con細(xì)胞fisetin處理組相比,P＜0.01。Fig.4 The role of Nrf2 in scavening ROS by fisetin(A～B)Expression of Nrf2 in sh-Nrf2 cells；(C)Scavenging effect of fisetin on ROS in sh-Nrf2 cells.**P＜0.01,compared with the control group；#P＜0.01,compared with the H2O2model group；&P＜0.01,when the H2O2model group of sh-Nrf2 cells was compared with that of sh-Con cells；△ P＜0.01,when the fisetin treatment group of sh-Nrf2 cells was compared with that of sh-Con cells.

本研究將細(xì)胞暴露于H2O2中以增加ROS水平。H2O2是一種重要的活性氧分子,能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多并造成細(xì)胞氧化損傷[21]。Ma等[22]選用 200 μmol/L H2O2作為 HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激與細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)物,處理4 h后細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組下降約49%。本研究結(jié)果表明,HepG2細(xì)胞經(jīng)500 μmol/L H2O2處理30 min后,細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組下降約51%,且細(xì)胞內(nèi)ROS增加。將fisetin干預(yù)組與H2O2模型組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)fisetin能夠提高細(xì)胞存活率并抑制細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生(表 1、圖 1)。Yen 等[23]發(fā)現(xiàn),fisetin(＜20 μmol/L)可恢復(fù)細(xì)胞活力并抑制衣霉素(tunicamycin,TM)處理引起的細(xì)胞凋亡、自噬和ROS產(chǎn)生。這與我們的研究結(jié)果相一致。然而,本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用fisetin(30 μmol/L)處理時(shí),ROS水平高于空白對(duì)照組,這可能與高濃度的fisetin誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生有關(guān)。相關(guān)報(bào)道稱,高濃度的fisetin(50 μmol/L)在人口腔癌細(xì)胞SCC-4中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS,降低線粒體膜電位,引起細(xì)胞凋亡[24]。此外,高濃度的fisetin(50 μmol/L)可抑制人胃癌細(xì)胞AGS和SUN-1的增殖,并誘導(dǎo)其ROS生成增加,產(chǎn)生細(xì)胞毒性[25]。因此,將來對(duì)于fisetin的開發(fā)利用仍需更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究。

現(xiàn)有研究表明,多種黃酮類化合物如槲皮素[26]、白藜蘆醇[27]、黃腐酚[28]等都是 Nrf2 的激活劑,可對(duì)Nrf2及Keap1的表達(dá)起調(diào)控作用。Zhang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)fisetin可通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制Nrf2的降解,使其發(fā)生核易位,并上調(diào)下游HO-1的表達(dá)。這為fisetin作為Nrf2激活劑的研究提供了理論依據(jù)。Nrf2/Keap1信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化通路之一,該通路的激活能夠誘導(dǎo)多種Ⅱ相抗氧化酶的表達(dá)。目前,關(guān)于Nrf2/Keap1途徑的機(jī)制學(xué)說有很多,基本可以分為兩種,即Keap1依賴性和Keap1非依賴性。在Keap1依賴性調(diào)節(jié)Nrf2-ARE途徑的學(xué)說中,Keap1被廣泛認(rèn)為是Nrf2激活的中樞負(fù)調(diào)節(jié)劑[29]。在我們的研究中,fisetin能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá),而下調(diào)Keap1的表達(dá)(圖3)；通過在Nrf2敲低細(xì)胞系中驗(yàn)證fisetin對(duì)ROS的清除效果發(fā)現(xiàn),Nrf2在fisetin清除細(xì)胞內(nèi)ROS的過程中具有關(guān)鍵性作用(圖4C)；同時(shí),在一定濃度范圍內(nèi),GCLC、GCLM、NQO1的表達(dá)水平在各組中雖并無明顯差異,但HO-1蛋白的表達(dá)水平有顯著增加(圖2),提示fisetin在HepG2細(xì)胞中可通過激活Keap1/Nrf2/ARE通路來促進(jìn)HO-1的表達(dá),從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

綜上所述,fisetin可通過激活Keap1/Nrf2/ARE通路來誘導(dǎo)HO-1的表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,從而在抗氧化損傷過程中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。