李 倩，朱曉嫚，王紀浩，謝巖黎*

(1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，中國河南鄭州450001；2.河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，中國河南鄭州450001；3.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院強磁場科學中心，中國安徽合肥230031)

在生命體中,從最小的單元——細胞到高級的組織、器官,它們在識別及相互作用過程中不僅存在著生物化學反應(yīng),而且存在著力學傳導,這些活動廣泛參與并影響著有機體的生長、發(fā)育、分化等生理及病理階段。生物力學的概念最早由蘇格蘭科學家D’Arcy Thompson在其“生長和形式上(On Growth and Form)”的報告中提出[1],之后越來越多的物理學家和生物學家投入到生物力學的研究工作中。隨著生物力學的發(fā)展,力學傳導的研究對象已經(jīng)從部分、簡單的環(huán)境轉(zhuǎn)向整體、復雜的生理環(huán)境,其研究手段也已經(jīng)從單一的物理學方法轉(zhuǎn)向與生物化學和分子遺傳學等方法聯(lián)用,這些都為深入理解力學信號如何轉(zhuǎn)換為生物學信號提供了重要基礎(chǔ)。

目前,細胞學效應(yīng)的研究熱點集中在細胞的黏附、遷移和分化,研究內(nèi)容包括黏著斑和骨架蛋白質(zhì)構(gòu)象及分布的變化、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成和重構(gòu)以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導等。微環(huán)境產(chǎn)生的力學因素包括靜態(tài)基質(zhì)的硬度、拓撲學性質(zhì),以及流動環(huán)境的剪切應(yīng)力、拉伸、壓力等。細胞生物學效應(yīng)與力學微環(huán)境密切相關(guān)。已有研究表明,不同組織、細胞發(fā)揮生物學活性的最佳基質(zhì)彈性模量不同,如脂肪、腦細胞為100 Pa左右,肌肉組織為1 kPa,結(jié)締組織為10 kPa,成骨細胞為100 MPa到15 GPa[2]。除了硬度之外,ECM蛋白質(zhì)、基質(zhì)是否連續(xù)、研究體系的維度(二維或三維)等都對細胞的黏附、遷移和分化產(chǎn)生重要的影響(圖1)。本文將重點闡述靜態(tài)基質(zhì)中的力學微環(huán)境對哺乳動物細胞的黏附、遷移、分化的影響以及細胞對ECM的力學反饋。

1 基質(zhì)微環(huán)境力學對細胞黏附的影響

首先,基質(zhì)硬度影響細胞的黏附,黏著斑和細胞骨架蛋白質(zhì)可直接反映黏附的強度[3]。早期的研究發(fā)現(xiàn),交聯(lián)度高的膠原蛋白(彈性模量30～100 kPa)上成纖維細胞的黏著斑穩(wěn)定,黏附強度高,而柔軟的凝膠(彈性模量在1 kPa左右)表面黏著斑呈現(xiàn)游離的、動態(tài)的變化,黏附強度低[2]?；|(zhì)硬度與黏附強度的正相關(guān)不僅存在于天然的ECM蛋白質(zhì)上,也存在于人工合成的多聚物凝膠上。Prager-Khoutorsky等[4]制備了不同彈性模量的聚二甲硅氧烷(polydimethysiloxane,PDMS)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAM),發(fā)現(xiàn)黏附在高硬度(5 kPa)多聚物上的成纖維細胞內(nèi)黏著斑小且數(shù)量多,肌動蛋白分布散亂,而在彈性模量高達2 MPa的凝膠上,細胞內(nèi)的黏著斑面積大、數(shù)量少,細胞骨架貫穿整個細胞。因此,黏著斑的聚集程度和細胞骨架的形貌可作為細胞黏附強度的一個重要指標。此外,基質(zhì)的硬度亦影響?zhàn)ぶ叩某墒爝^程。相關(guān)研究報道,在硬度高的表面,細胞呈現(xiàn)各向同性的鋪展,黏著斑由初始形成到成熟的過程重復出現(xiàn)[5],而在硬度低的表面,只能檢測到細胞的初始黏附[6]。Jalali等[7]用原子力顯微鏡進一步研究發(fā)現(xiàn),在硬度為218.85 Pa、385.58 Pa和933.2 Pa的PAM上,內(nèi)皮細胞的最大解離力分別為0.28 nN、0.94 nN和1.99 nN,直接證明了硬度和黏附強度之間的量化關(guān)系。Rigato等[8]用原子力顯微鏡掃描發(fā)現(xiàn),在硬度高的表面,細胞內(nèi)聚集有更緊密的肌動蛋白纖維束?？偟膩碇v,基質(zhì)硬度作用于黏著斑和細胞骨架蛋白質(zhì),引起它們的形貌和組裝變化,從而共同影響細胞的黏附強度。

圖1 基質(zhì)微環(huán)境力學對細胞黏附、遷移和分化的影響Fig.1 The influence of matrix microenvironment mechanics on cell adhesion,migration and differentiation

其次,細胞黏附受ECM蛋白質(zhì)的調(diào)控[9～12]。作為纖連蛋白序列中研究較多的小肽RGD(arginine-glycine-aspartic acid),它對成纖維細胞黏附的影響表現(xiàn)在其間距上。Arnold等[9]用納米光刻技術(shù)制備了納米圖案化的RGD,發(fā)現(xiàn)當RGD的間距在58～73 nm時,細胞黏著斑穩(wěn)定,而當距離大于73 nm時,細胞黏附能力減弱,這是由于過大的配體位點間距使整合素無法聚集成簇,導致黏著斑形成異常,從而引起細胞骨架蛋白質(zhì)無法與其有效錨定。Ma等[13]運用微圖案化技術(shù)也發(fā)現(xiàn),x-y軸上修飾的各向異性纖連蛋白促進了間充質(zhì)干細胞的黏附。我們制備了纖連蛋白和RGD修飾的鈦合金,通過對間充質(zhì)干細胞的單細胞力譜展開研究,發(fā)現(xiàn)在纖連蛋白III8～10結(jié)構(gòu)域修飾的表面,細胞解離力比在RGD修飾的表面大,因此,我們推測基質(zhì)硬度相似時,細胞黏附強度與蛋白質(zhì)提供的黏附位點密度有關(guān)[14]。

最后,細胞黏附受到基質(zhì)硬度和蛋白質(zhì)的共同調(diào)控,但過高的硬度和配體濃度并不能使黏著斑持續(xù)增大。Oria等[15]指出,當基底的彈性模量在10～100 kPa時,間距100 nm的RGD上人乳腺肌上皮細胞的黏著斑最大,200 nm間距的配體上黏著斑最小,而當基底彈性模量小于10 kPa時,大間距的配體反而促進細胞的黏附。此外,計算機模擬和細胞學實驗都表明,基質(zhì)的高硬度外加高配體濃度使黏附區(qū)域中整合素的數(shù)量達到飽和,黏附力無法重新分配,從而導致黏著斑瓦解。因此,硬度與配體濃度如何精確調(diào)控細胞黏附尚需進一步實驗驗證,并且細胞類型與力學微環(huán)境的關(guān)聯(lián)也需要深入探討。

2 基質(zhì)微環(huán)境力學對細胞遷移的影響

不同類型的細胞在相同的基質(zhì)中遷移速度不同,同一類型細胞的遷移又受到其力學微環(huán)境(如硬度、基質(zhì)的連續(xù)性和骨架蛋白質(zhì)拉應(yīng)力等)的影響。同時,細胞的遷移產(chǎn)生牽引力,在細胞外基質(zhì)重建及細胞形態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用,與正常生理狀態(tài)的維持和病理狀態(tài)的發(fā)生密切相關(guān)。

2.1 細胞遷移的影響因素

普遍的觀點認為硬度高的基質(zhì)促進細胞遷移,即細胞遷移有趨硬性,這在多種類型的細胞(如成纖維細胞、白細胞、腫瘤細胞等)中均有發(fā)現(xiàn)[16～17]。特別是腫瘤細胞,其發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中局部基質(zhì)硬度的變化范圍非常大(170 Pa～1.2 kPa)[18],因此,研究硬度與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尤為重要,是近些年來的研究熱點。已有研究表明,卵巢癌細胞SKOV3能夠在PAM表面從低硬度(3 kPa)區(qū)域遷移至高硬度(25 kPa)區(qū)域[19],神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251在PAM上的最佳遷移硬度大約是100 kPa[20]。此外,基質(zhì)的硬度范圍對癌細胞的遷移也有重要的影響,例如:在不同硬度范圍的PDMS上肺腺癌細胞A549的遷移狀態(tài)和遷移率均有所不同,在低硬度范圍(27～107 kPa)內(nèi),細胞呈獨立運動形式,遷移速度快,總遷移距離長,而在高硬度范圍(1.5～4.8 MPa)內(nèi),細胞呈群體運動,遷移速度很慢,總遷移距離短[21]。在此基礎(chǔ)上,Duchez等[22]研究了多種類型的癌細胞,包括惡性膠質(zhì)瘤細胞U87-MG和T98G、乳腺癌細胞MDA-MB-231以及纖維肉瘤細胞HT1080,發(fā)現(xiàn)它們僅在低硬度范圍(2～7 kPa)內(nèi)的PAM上有明顯的遷移,而在高硬度范圍內(nèi)無明顯遷移。除此之外,也有研究表明干細胞的趨硬性和硬度的梯度范圍相關(guān)。Hadden等[23]發(fā)現(xiàn)脂肪源干細胞在基質(zhì)硬度梯度為2.9～8.2 kPa/mm時,表現(xiàn)出趨硬性,而當基質(zhì)的硬度梯度在0.5～2.9 kPa/mm時,并無趨硬性。

其次,基質(zhì)的連續(xù)性對細胞遷移有重要的影響,它是通過作用于黏著斑的解體、細胞骨架蛋白質(zhì)的動力學變化[24～25]來實現(xiàn)的。連續(xù)基質(zhì)是指基質(zhì)表面缺口很小,與細胞相比可以忽略不計,而不連續(xù)基質(zhì)上的缺口往往達到上百納米。二維連續(xù)基質(zhì)上細胞的黏附產(chǎn)生正反饋,促進肌動蛋白的動力學組裝,加快細胞前端偽足的運動,而在非連續(xù)基質(zhì),細胞的遷移無法通過黏附得以增強[16]。三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部細胞的遷移更為復雜。在不連續(xù)的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部,L?mmermann等[26]發(fā)現(xiàn),將整合素全部敲除之后,白細胞在膠原蛋白三維體系中的運動未受影響。因此,在微環(huán)境中,細胞的遷移是個復雜的過程,然而不可否認的是,黏著斑與細胞骨架蛋白質(zhì)之間并不總是協(xié)同的相互作用。

2.2 細胞遷移對力學微環(huán)境的影響

Harris等[27]于1980年發(fā)現(xiàn)了硅膠表面黏附細胞產(chǎn)生的褶皺,并首次提出了牽引力的概念。牽引力是細胞對基質(zhì)產(chǎn)生的作用力,是研究細胞遷移的重要參數(shù),同時,細胞遷移過程中還伴隨有細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運、表型的轉(zhuǎn)化以及ECM的重建。力學微環(huán)境與細胞遷移之間的相互作用廣泛參與一系列生理和病理反應(yīng),如B細胞免疫應(yīng)答、內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持、組織纖維化、癌癥轉(zhuǎn)移及心血管疾病發(fā)生等。已有研究報道,當PAM凝膠的硬度(0.5～1 kPa)與抗原遞呈細胞接近時,B細胞發(fā)生免疫應(yīng)答而被激活,產(chǎn)生10～20 nN的牽引力[28]。在轉(zhuǎn)錄因子的定位上,Mckenzie等[19]發(fā)現(xiàn),卵巢癌細胞SKOV3向高硬度的PAM上轉(zhuǎn)移時轉(zhuǎn)錄因子YAP1從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核。細胞表型轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn),高硬度的PAM(25 kPa)使胰腺星狀細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,分泌更多的ECM,導致組織纖維化[29]。Ondeck等[30]在可調(diào)控硬度的異丁烯酸甲酯(methacrylated hyaluronic acid,MeHA)上觀測到乳腺上皮細胞的癌變過程,并且這個過程還和孵育時間密切相關(guān)。人們通過對多種病變組織細胞表型和細胞骨架蛋白質(zhì)進行鑒定發(fā)現(xiàn),成纖維細胞通常去分化為肌成纖維細胞,分化后的細胞一方面分泌大量的ECM蛋白質(zhì),另一方面通過細胞表面蛋白質(zhì)聯(lián)合ECM蛋白質(zhì)對微環(huán)境產(chǎn)生巨大的拉力,從而共同提高局部組織的硬度[31～32]。病理組織的細胞牽引力實驗也表明,與正常組織細胞相比,類風濕性關(guān)節(jié)炎和心肌梗塞組織中的B細胞和心肌細胞都產(chǎn)生了更大的牽引力[28,33]。因此,高硬度的基質(zhì)引起細胞牽引力增大,是組織纖維化的原因之一。有趣的是,較大的牽引力并不總是引發(fā)組織纖維化,Elosegui-Artola等[12]提出,雖然局部的病變組織硬度升高,但是細胞卻產(chǎn)生了較小的牽引力,使組織又恢復正常的硬度,從而維持機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。值得注意的是,基質(zhì)硬度和牽引力之間的非絕對正相關(guān)關(guān)系,不僅存在于二維平面上,也被報道存在于三維體系中。Steinwachs等[34]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞在0.6～2.4 mg/mL的膠原蛋白凝膠中的移動速度均勻,產(chǎn)生的牽引力強弱變化規(guī)律,不受硬度的影響。此外,在硬度相同的3D膠原蛋白中,Koch等[35]通過比較幾種不同的癌細胞,發(fā)現(xiàn)雖然侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-231和肺癌細胞A-125較非侵襲性的MCF-7和A-549細胞產(chǎn)生的牽引力大,但是非侵襲性外陰癌細胞A-431卻產(chǎn)生了最大的牽引力。因此,牽引力的大小并不能作為衡量癌細胞侵襲力的唯一指標。

綜上所述,細胞遷移受到復雜環(huán)境的影響,硬度與牽引力、組織纖維化之間的關(guān)系尚無定論,細胞牽引力的改變能否作為組織病變的早期檢測指標之一也不明確。因此,研究細胞的遷移需要綜合考慮所用細胞類型、基底硬度、二維或三維結(jié)構(gòu)等多重因素。

3 基質(zhì)微環(huán)境力學對細胞分化的影響

基底的硬度除了能夠誘導細胞短期的黏附和遷移之外,還能夠長期影響細胞分化[36～37]。由于凝膠本身并不具備細胞黏附位點,因此在實驗中往往以物理吸附或者共價修飾的方法結(jié)合ECM蛋白質(zhì),如纖連蛋白、膠原蛋白等。大多數(shù)的觀點認為,基質(zhì)的局部硬度與干細胞分化方向之間存在正相關(guān)。Sun等[38]發(fā)現(xiàn)玻連蛋白覆蓋的PDMS微陣列柱子可調(diào)控人全能干細胞的分化,硬度高的PDMS(1.2 MPa)誘導干細胞分化為成骨細胞,而硬度低的PDMS(5 kPa)則誘導干細胞分化為脂肪細胞,甚至當培養(yǎng)液中加入Smad抑制劑時,干細胞還可被誘導成為脊髓運動神經(jīng)元。Vertelov等[39]制備了膠原蛋白Ⅰ覆蓋的硅膠,發(fā)現(xiàn)當硅膠硬度為64 kPa時干細胞向成骨細胞分化,但是當其硬度較低時(0.5～16 kPa)則誘導間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化。該研究還發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)液的成分是細胞分化的輔助條件。此外,在復雜的海藻酸-瓊脂糖和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)dimethacrylate,PEGDA)三維系統(tǒng)中,人們發(fā)現(xiàn)干細胞也存在著相似的分化趨勢[40]。最近,Choi等[41]對骨髓微環(huán)境進行分析時發(fā)現(xiàn),當PAM的硬度與骨內(nèi)膜(44 kPa)接近時,干細胞繁殖快,而當PAM的硬度與血管區(qū)(3 kPa左右)接近時,細胞趨向分化。相似的研究表明,當膠原蛋白Ⅰ涂覆的PAM硬度在0.5～10 kPa時,骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞和軟骨細胞分化趨勢明顯,而當PAM硬度高于20 kPa時,干細胞向心肌細胞和成骨細胞方向分化不明顯[42]。張書寧等[43]比較了不同的基質(zhì)材料,發(fā)現(xiàn)較硬度高(＞1 GPa)的玻璃基質(zhì),CD34+細胞能夠被低硬度(約15 kPa)的PAM誘導分化為內(nèi)皮系細胞。

然而,目前的研究對干細胞分化與不同材料基質(zhì)的整體硬度之間的關(guān)系并沒有得到一致的結(jié)論。Trappmann等[44]比較了膠原蛋白共價修飾的PDMS和PAM,發(fā)現(xiàn)在整體硬度為0.1 kPa～2.3 MPa的PDMS上,角朊細胞的分化不受硬度改變的影響,間充質(zhì)干細胞在此范圍內(nèi)都向成骨細胞分化,而在硬度低(0.5 kPa)的PAM表面,角朊細胞和間充質(zhì)干細胞都向脂肪細胞分化,在硬度高(＞2 kPa)的PAM表面,兩種細胞都向成骨細胞分化。該研究還指出,即使PDMS和PAM的硬度相同,但是低硬度的PAM孔隙率較大,這直接導致PAM與膠原蛋白的交聯(lián)度低、蛋白質(zhì)配體間距大,因此,文章提出的結(jié)論是,干細胞的分化受局部錨定位點上膠原蛋白硬度的影響,并不受基底整體彈性模量的控制[44]。針對孔隙率和蛋白質(zhì)交聯(lián)度對細胞分化的影響,現(xiàn)有研究也存在不同的結(jié)論。Wen等[45]制備了 3 種硬度(4 kPa、13 kPa 和 30 kPa)的PAM,它們可分別誘導干細胞向脂肪細胞、肌肉細胞和成骨細胞分化,當保持PAM的硬度不變時,通過調(diào)節(jié)孔隙大小在88～160 nm和RGD共價交聯(lián)濃度在0.1～2.5 mmol/L,發(fā)現(xiàn)干細胞的分化方向均無改變。除此之外,相關(guān)研究指出,表面修飾蛋白質(zhì)的類型也會影響干細胞的分化方向,如層粘連蛋白促使干細胞向脂肪細胞分化,纖連蛋白則促使干細胞向成骨細胞分化[41]。綜上所述,探究微環(huán)境的細胞分化需要綜合考慮基底的材料、硬度范圍、孔隙率、修飾蛋白質(zhì)的類型和密度等多種因素。

深入的細胞信號轉(zhuǎn)導分析表明,微環(huán)境之所以能夠影響細胞分化,主要是由于細胞核是通過LINC(linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)-巢蛋白復合物與細胞骨架直接相連的[46],力學信號能夠通過細胞骨架傳導入細胞核。長期的力學信號刺激可引起相關(guān)基因的上調(diào)/下調(diào)以及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達變化,其中研究較多的是YAP(Yes-associated protein)和 TAZ(tafazzin)蛋白[47～48]。Dupont等[48]報道,在間充質(zhì)干細胞分化過程中,細胞核內(nèi)的YAP和TAZ蛋白能夠直接感受ECM的硬度,其激活過程需要Rho GTP酶的參與,且獨立于Hippo/LATS信號通路。Sun等[38]也提出,當PDMS的硬度變化時,人全能干細胞的Rho GTP酶參與的Hippo/YAP通路被激活,與之前研究不同的是,這個通路的激活需要LATS介導。Totaro等[49]在制備纖連蛋白修飾的PAM時發(fā)現(xiàn),當PAM的彈性模量在0.7～2 kPa之間時,YAP/TAZ在細胞質(zhì)中定位,下游Notch通路被激活,上皮干細胞開始分化；當彈性模量高于8 kPa時,YAP/TAZ轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),Notch通路被抑制,干細胞的干性得以維持?；谏鲜龇治隹芍?力學微環(huán)境產(chǎn)生的信號能夠調(diào)控細胞核內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運,這對于干細胞是否分化起著決定性的作用。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,首先,基質(zhì)的硬度和蛋白質(zhì)配體的濃度影響細胞黏附中黏著斑和骨架蛋白質(zhì)的形貌和分布,然而過高的硬度和配體濃度并不能使黏著斑持續(xù)增強；其次,多種類型的細胞遷移有趨硬性,不僅如此,細胞遷移往往還參與了細胞外基質(zhì)的重建,特別是細胞病變的發(fā)生；最后,細胞的硬度在很大程度上影響了細胞的分化,同時基質(zhì)的孔隙度、蛋白質(zhì)類型等也是不可忽視的影響因素。

研究力學微環(huán)境與細胞生物學效應(yīng)的關(guān)系在醫(yī)學應(yīng)用上有著重要的意義。例如,癌癥細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移受到力學微環(huán)境的調(diào)控,因此,通過改變腫瘤細胞的微環(huán)境,改變其物理化學性質(zhì),進而調(diào)控細胞對力學信號的響應(yīng)[31],是研發(fā)腫瘤靶向藥物的策略之一。在醫(yī)學工程領(lǐng)域,理想的支架等仿生材料需要滿足幾個條件:1)精確匹配待修復組織的力學性能；2)具備良好的生物學性能,以達到良好的組織相容性、承重性、降解性等。目前,激光、磁場及原子信號掃描等研究技術(shù)已與傳統(tǒng)的生物學方法聯(lián)合,這些先進的研究方法和手段將為深入探索力學微環(huán)境下的細胞和分子機制提供一定的技術(shù)支持。