丁美珍 福建省光澤縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 福建光澤 354100

黏膜既存在局部免疫又存在共同免疫系統(tǒng)，黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體相對獨立的免疫系統(tǒng)[1]，病原微生物入侵畜禽機(jī)體時，腸道黏膜免疫系統(tǒng)能夠起到阻礙和抵御作用[2]，在腸道免疫防御中起重要作用的包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞[3]。因此，需要通過試驗為番鴨感染呼腸孤病毒后十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化提供論證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 1日齡番鴨若干；試驗毒株及主要材料：番鴨呼腸孤病毒、番鴨種蛋若干。

1.1.2 試驗主要試劑和器材 試驗室自配的4%多聚甲醛固定液、蘇木精染液、1%伊紅染液、1%鹽酸酒精；處理過的蓋玻片及載玻片；恒溫水浴鍋；恒溫干燥箱；高壓滅菌鍋；移液管；超凈工作臺；冰箱；組織研磨器；冷凍離心機(jī)；切片機(jī)；廣口瓶；滅菌紗布、剪刀、鑷子等。

1.2 試驗方法

1.2.1 擴(kuò)增番鴨呼腸孤病毒 孵化1周的40枚番鴨種蛋，經(jīng)卵黃囊接種番鴨呼腸孤病毒后第4～6 d共死亡26枚，收取死亡鴨胚的胚體及尿囊液，用組織研磨器、冷凍離心機(jī)擴(kuò)增番鴨呼腸孤病毒，并放入-20℃冰箱中儲存待用。

1.2.2 試驗動物分組 將100羽1日齡無MDRV感染的番鴨進(jìn)行隨機(jī)分組：同居感染組（ICG）40羽、空白對照組（NCG）40 羽、人工感染組（AIG）20 羽。人工感染組的每羽番鴨腿部肌注200 uL番鴨呼腸孤病毒液，攻毒后第3 d將人工感染MDRV并做好標(biāo)記的番鴨放入ICG組進(jìn)行感染，標(biāo)記同居感染時間，試驗番鴨都正常進(jìn)行自由采食和飲水。

1.2.3 取樣及組織切片制作

1.2.3.1 取樣及固定 同居感染后第2 d、3 d、4 d、6 d、9 d、15 d每組隨機(jī)抽取番鴨各5羽，用滅菌消毒的試驗剪剪取十二指腸腸段約1 cm，無菌洗凈后放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3.2 組織切片制備 用常規(guī)法將采集的組織樣本制備成石蠟組織切片，用中性樹膠及蓋玻片封片，組織切片采用HE染色。

1.2.3.3 腸絨毛上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞計數(shù) 光學(xué)顯微鏡下觀察腸絨毛上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分布與數(shù)量。具體方法為：每個試驗組選取5張著色良好的切片，每張切片均隨機(jī)抽取5根最長且排列整齊的腸絨毛在40×10倍顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并計數(shù)，對每一百個上皮柱狀細(xì)胞間的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理 用SPSS.17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

正常番鴨十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)較為完整，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量較多（見圖1）；感染呼腸孤病毒的番鴨十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，計數(shù)單位內(nèi)的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞均相對減少（見圖2）。由表1、圖3可以看出，NCG組番鴨在試驗生長過程中，其十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量較多且浮動較小；感染MDRV的ICG組番鴨，其十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量在第4 d先出現(xiàn)明顯下降，在無外在干預(yù)的條件下，之后略有上升但數(shù)量依舊維持在較低水平，與NCG組相比分別降低13.78%、23.73%、33.07%、32.02%、33.68%、30.76%，差異均極顯著（P＜0.01）。

圖1 正常番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞

圖2 MDRV感染番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞

3 討 論

在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)NCG組的番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量波動不明顯，ICG組番鴨在病毒感染后的第2～4 d，其十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞下降較快，在感染呼腸孤病毒第4 d，十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量最少。該試驗現(xiàn)象表明，呼腸孤病毒感染會破壞腸黏膜結(jié)構(gòu)，致使番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量在防御過程中大量減少。感染呼腸孤病毒的番鴨在第6 d、9 d、15 d，其十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯減少后便維持在一個相對較低的水平，試驗數(shù)據(jù)證明番鴨在感染呼腸孤病毒后十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)減少且不易恢復(fù)正常。

表1 試驗番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量情況

圖3 番鴨十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化