丁 婕，魯 理，楊 南，董 凱

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院,安徽 蕪湖 241002；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科,安徽 合肥 230001)

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)是指視網(wǎng)膜色素上皮層、神經(jīng)感覺層分離。盡管該手術(shù)治愈率已大為提高，但多數(shù)患者視力恢復(fù)不佳，究其原因不難發(fā)現(xiàn)，視力的喪失主要和視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞死亡情況有關(guān)，但這類死亡機(jī)制尚未完全明了。壞死性凋亡(Necroptosis)是一種不依賴半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的可調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，它具有凋亡和壞死的共同特征，表現(xiàn)為細(xì)胞核凝聚，細(xì)胞膜喪失，染色質(zhì)邊聚[1]。Degterev應(yīng)用半胱氨酸蛋白酶抑制劑z-VAD-FMK抑制凋亡后，發(fā)現(xiàn)并不能抑制細(xì)胞的死亡，探究其原因發(fā)現(xiàn)了一種TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死途徑并將其命名為壞死性凋亡[1]。受體相互作用蛋白1(RIP-1)是壞死性凋亡通路中的必須物質(zhì)，它有其特異性抑制劑Necrostatin-1[2-4]。本課題組的前期研究中，在視網(wǎng)膜脫離后，應(yīng)用z-VAD-FMK干預(yù)發(fā)現(xiàn)光感受器細(xì)胞凋亡受到抑制，壞死性凋亡明顯增加，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合Necrostatin-1，不僅抑制RIP-1的表達(dá)，細(xì)胞的壞死性凋亡也受到顯著抑制，在神經(jīng)功能學(xué)上也證實(shí)了Necrostatin-1對(duì)視網(wǎng)膜具有一定的保護(hù)作用[4-6]。但是視網(wǎng)膜脫離后，壞死性凋亡發(fā)生的機(jī)制仍是討論的熱點(diǎn)。有學(xué)者提出，細(xì)胞的程序性壞死伴有ROS的產(chǎn)生[7-9]。ROS是生物體內(nèi)含氧化合物的總稱，主要由線粒體產(chǎn)生，眾所周知，氧化應(yīng)激伴有大量的活性氧堆積，但是在視網(wǎng)膜脫離模型中，尚未清楚組織缺血缺氧死亡受體通路激活，ROS是否也參與到壞死性凋亡中。因此，我們通過構(gòu)建大鼠視網(wǎng)膜脫離模型，采用z-VAD-FMK和Necrostatin-1干預(yù)，探討光感受器細(xì)胞壞死性凋亡中是否有ROS的參與并初步探討ROS與RIP-1的關(guān)系，為以后通過干預(yù)ROS抑制光感受器細(xì)胞死亡，提高患者術(shù)后視力奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型構(gòu)建 SD正常成年雄性大鼠60只，體質(zhì)量270～300 g，安徽醫(yī)科大學(xué)提供。本研究實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守美國(guó)視覺眼科研究學(xué)會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和安徽醫(yī)科大學(xué)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定。參照文獻(xiàn)[4]的方法，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，術(shù)前可樂必妥滴眼液(參天制藥有限公司)清洗結(jié)膜囊，托吡卡胺擴(kuò)瞳，左眼注入透明質(zhì)酸鈉(1% 美國(guó)博士倫公司) 50 μL于視網(wǎng)膜下建立視網(wǎng)膜脫離模型，網(wǎng)膜隆起范圍約1/2～2/3。每只大鼠僅左眼建立視網(wǎng)膜脫離模型，每?jī)蓚€(gè)視網(wǎng)膜為一個(gè)樣本，每組6只大鼠。

視網(wǎng)膜取材方法，用10%的水合氯醛行大鼠腹腔麻醉后，用剪刀將結(jié)膜囊與眼球分離，暴露眼球后沿神經(jīng)根部剪斷，摘除術(shù)眼眼球置于冰上，顯微剪沿角鞏膜緣位置一圈剪開，剔除眼內(nèi)容物，顯微鑷托起視網(wǎng)膜置于PBS中。

1.2 活性氧(ROS)和受體相互作用蛋白1(RIP-1)的表達(dá) 在正常對(duì)照組和單純視網(wǎng)膜脫離組，檢測(cè)視網(wǎng)膜脫離不同時(shí)間點(diǎn)(d1、d3、d5、d7、d14)ROS和RIP-1的表達(dá)情況，為藥物干預(yù)做準(zhǔn)備。

1.3 z-VAD-FMK和Necrostatin-1干預(yù)對(duì)ROS表達(dá)的影響 取大鼠24只，按照上述方法建立視網(wǎng)膜脫離模型，同時(shí)采用微量注射器在視網(wǎng)膜下注射z-VAD-FMK(5 μL,300 μmol/L,Enzo,PA,USA)；此為z-VAD-FMK組。將Necrostatin-1 (5 μL,400 μmol/L,Merck,Darmstadt,Germany) 以及 z-VAD-FMK(劑量與前一組一致)視網(wǎng)膜下注射，此為z-VAD-FMK+ Necrostatin-1組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與正常對(duì)照組和單純視網(wǎng)膜脫離組進(jìn)行比較，觀察藥物干預(yù)下，ROS表達(dá)的變化(濃度參考文獻(xiàn)[4])。

1.4 western blot檢測(cè) 用RIPA裂解液與1%的蛋白酶抑制劑充分裂解，組織勻漿、超聲、離心、行BCA蛋白濃度檢測(cè)定量；取40 μg蛋白上樣后凝膠電泳(SDS-PAGE)，初始65 V，當(dāng)?shù)鞍孜挥跐饪s膠、分離膠交界處，提升為125 V；冰上轉(zhuǎn)膜2 h，25 V；5%脫脂牛奶室溫封閉40 min；一抗(Cell Signaling Technology 1∶1000)4℃孵育過夜；復(fù)溫完成時(shí)回收一抗，TBST洗膜(10 min×3次)；兔二抗(Cell Signaling Technology 1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗滌后，ECL顯影。

1.5 ROS檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取30 mg新鮮視網(wǎng)膜，PBS清洗，充分勻漿后離心20 min(3000 r/min)，取上清液。參照大鼠活性氧(ROS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書(Andy Gene)進(jìn)行操作，首先制備標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣，加入待測(cè)樣品10 μL和樣品稀釋液40 μL，37℃溫育30 min，配液洗滌后每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，37℃避光顯色15 min，每孔加終止液 50 μL，終止反應(yīng)。最終在450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組變量之間的比較采用單因素方差分析，兩兩之間的比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜脫離后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)RIP-1及ROS表達(dá)的比較 結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜脫離后d1～d14時(shí)間節(jié)點(diǎn)RIP-1的表達(dá)高于attached組(P<0.05)；視網(wǎng)膜脫離后d1～ d14時(shí)間節(jié)點(diǎn)ROS的表達(dá)高于attached組(P<0.05)。RIP-1和ROS均于視網(wǎng)膜脫離后第3天達(dá)高峰,d3組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1和表2。

圖1 western blot檢測(cè)RIP-1蛋白的表達(dá)

表1 視網(wǎng)膜脫離后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)RIP-1的表達(dá)情況

分組nRIP-1attached組30.35±0.02d1組30.58±0.03?d3組30.72±0.03?#d5組30.53±0.03?d7組30.50±0.02?d14組30.41±0.05?F58.187P0.000

注：與attached組比較，*P<0.05；d3組與其他各組比較，#P<0.05。

表2 視網(wǎng)膜脫離后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)ROS的表達(dá)情況

分組nROS/(IU/mL)attached組3214.33±16.92d1組3764.33±12.66?d3組31033.67±30.44?#d5組3871.67±19.86?d7組3562.00±33.87?d14組3374.33±25.42?F487.215P0.000

注：與attached組比較，*P<0.05；d3組與其他各組相比，#P<0.05。2.2 各組大鼠ROS表達(dá)的比較 根據(jù)時(shí)間峰值，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，以視網(wǎng)膜脫離第3天為時(shí)間節(jié)點(diǎn)取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行ROS檢測(cè)。結(jié)果顯示，z-VAD-FMK組ROS表達(dá)最高，與其他3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在z-VAD-FMK的基礎(chǔ)上，予以Necrostatin-1干預(yù)后抑制了ROS表達(dá)，雖然高于attached組，但較untreated組及z-VAD-FMK組的ROS表達(dá)降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠ROS表達(dá)的比較

分組nROS/(IU/mL)attached組3214.33±16.92auntreated組31019.00±42.79bz-VAD-FMK組31302.67±38.07cz-VAD +Nec-1組3559.33±16.65dF727.182P0.000

注：多組間兩兩比較符號(hào)不同表示P<0.05。

3 討論

視網(wǎng)膜脫離屬于一種嚴(yán)重致盲性疾病，光感受器細(xì)胞死亡會(huì)對(duì)其視力帶來負(fù)面作用。視網(wǎng)膜脫離后，感光細(xì)胞的壞死性凋亡是近些年研究的熱點(diǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離后，ROS的表達(dá)在第3天達(dá)高峰，并且可以被RIP-1的特異性抑制劑Necrostatin-1所抑制，ROS可能作為RIP-1的下游共同調(diào)控光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡。

線粒體活性氧簇與程序性細(xì)胞壞死之間的關(guān)系是各領(lǐng)域長(zhǎng)期研究的一個(gè)問題。RIP-1作為壞死性凋亡上的關(guān)鍵蛋白，其與ROS之間的關(guān)系以及在壞死性凋亡中如何發(fā)揮作用是亟待解決的關(guān)鍵點(diǎn)。關(guān)于活性氧和程序性細(xì)胞死亡的研究早在19世紀(jì)末，在對(duì)L929小鼠成纖維細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，ROS清除劑能夠抑制程序性細(xì)胞壞死。在近些年來的研究中，關(guān)于活性氧與壞死性凋亡的關(guān)系，各學(xué)者看法不一。有學(xué)者在對(duì)Neoalbaconol(NA)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性細(xì)胞壞死的機(jī)制上研究發(fā)現(xiàn)NA可導(dǎo)致RIP-3介導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)壞死性凋亡[10]。韓家淮課題組研究出ROS通過氧化RIP-1蛋白上的3個(gè)半胱氨酸(C257、C268、C586)和增強(qiáng)第161位(S161)絲氨酸位點(diǎn)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)程序性細(xì)胞壞死[9]。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為ROS與壞死性凋亡沒有直接聯(lián)系。RIP-1和RIP-3激酶通過與GLUL、PYGL等糖代謝水平中的關(guān)鍵酶相互作用，通過影響線粒體的代謝而間接提高了ROS 的產(chǎn)生[11]。有學(xué)者通過線粒體自噬的結(jié)果表明活性氧并不是壞死性凋亡的直接原因，他表示在TNF的刺激下，活性氧的產(chǎn)生只是個(gè)伴隨現(xiàn)象[12]。更典型的反例是在對(duì)TNF誘導(dǎo)的人的結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29的細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞程序性壞死與ROS無關(guān)[13]。學(xué)者們各抒己見，然而在視網(wǎng)膜脫離中，并未見對(duì)ROS與壞死性凋亡的直接研究。

我們課題組前期在對(duì)視網(wǎng)膜脫離后壞死性凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡在病理學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞及細(xì)胞器腫脹，胞膜不完整，胞核凝集，不連續(xù)以及自噬泡的產(chǎn)生。z-VAD-FMK使光感受器細(xì)胞從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃佬缘蛲?，RIP-1表達(dá)增加，Necrostatin-1可以抑制RIP-1的磷酸化進(jìn)而抑制光感受器的壞死性凋亡[4-5]。關(guān)于ROS的研究是對(duì)課題的延伸與進(jìn)展，我們發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離后RIP-1、ROS表達(dá)升高，并都于第3天達(dá)到高峰。與此前課題組對(duì)視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞死亡高峰節(jié)點(diǎn)相一致[14]?？芍猂OS與RIP-1在細(xì)胞死亡通路上有一定的聯(lián)系。之后通過z-VAD-FMK和Necrostatin-1聯(lián)合干預(yù)觀察ROS表達(dá)情況：視網(wǎng)膜脫離后，z-VAD-FMK組ROS表達(dá)增加，Necrostatin-1通過抑制壞死性凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白R(shí)IP-1，ROS的表達(dá)也明顯下降。進(jìn)而得知ROS作為RIP-1的下游共同調(diào)控細(xì)胞的壞死性凋亡。ROS的檢測(cè)方法有多種,Trichonas等[3]此前在視網(wǎng)膜脫離后通過檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基含量得出RIP-1的下游伴有ROS的產(chǎn)生。而我們課題組是通過直接檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中的ROS，得出與其相一致的結(jié)果，在今后的實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)進(jìn)一步用其他方法多方面驗(yàn)證。

關(guān)于視網(wǎng)膜脫離后活性氧與壞死性凋亡之間的關(guān)系，仍有很多需解決的問題。我們只探究到了視網(wǎng)膜脫離后，ROS作為RIP-1的下游參與到細(xì)胞的壞死性凋亡，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。此外，有研究證實(shí)自噬可以采用去除受損線粒體或氧化蛋白來下調(diào)ROS氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活[15-16]。那么在以后的研究中，我們將探索自噬激活后，是否可以通過抑制ROS進(jìn)而抑制光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡。通過對(duì)活性氧的研究，可以進(jìn)一步闡釋光感受器細(xì)胞自噬與壞死性凋亡之間的關(guān)系，能夠?yàn)榻窈笈R床上視網(wǎng)膜脫離患者的治療提供一個(gè)新的理論基礎(chǔ)及干預(yù)靶點(diǎn)，有一定的臨床意義。