李慶登，徐文琴，高云星，湯興麗，余方流

(皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)是引起結(jié)核病的慢性感染性病原體。2016年WHO年報(bào)顯示，全球結(jié)核病新發(fā)病例1040萬，死亡病例180萬。我國結(jié)核疫情也非常嚴(yán)峻[1]。近年來，隨著對H37Ra菌株致病能力與相關(guān)毒力基因功能逐步闡明，其越來越成為結(jié)核病研究中重要的工具菌[2-3]。白細(xì)胞介素-35(Interleukin-35，IL-35)屬于IL-12家族中的一種負(fù)向調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，有EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)和p35兩個(gè)亞基[4]。研究表明：IL-35主要通過抑制T細(xì)胞增殖和分泌而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[5-6]。目前，結(jié)核分枝桿菌作為一種感染性病原體，其感染與免疫機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株感染小鼠，檢測在感染及其不同時(shí)段的脾組織IL-35mRNA的表達(dá)情況，著重分析IL-35對于結(jié)核分枝桿菌感染的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級C57BL/6小鼠(雌性，6～8周齡)，購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。M.tb減毒株由江蘇省疾控中心贈(zèng)送。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)。FastStart Essential DNA Green Master試劑盒(羅氏公司)。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 主要儀器 ESCO Class Ⅱ生物安全柜，AB SimpliAmp PCR儀，羅氏LightCycler?96 qPCR儀。

1.3 動(dòng)物感染

1.3.1 感染方法 接種環(huán)挑取培養(yǎng)好的菌落，用生理鹽水制成單個(gè)菌懸液，調(diào)整菌液濃度至1 × 106/mL。采用尾靜脈注射方式感染，感染劑量為每只小鼠1 × 105CFU。

1.3.2 一般生理狀況 在感染前對小鼠進(jìn)行標(biāo)記并測體質(zhì)量；感染后對小鼠進(jìn)行一般狀況觀察：活動(dòng)狀態(tài)、飲食、毛發(fā)、體質(zhì)量等。體質(zhì)量指數(shù)=感染后質(zhì)量/感染前質(zhì)量×100%；脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠質(zhì)量×100%。

1.3.3 肺組織活菌計(jì)數(shù) 處死小鼠后取出其左肺進(jìn)行研磨，研磨后的勻漿加入本身體積3倍左右的濃度為4%的硫酸溶液混勻靜置20 min以去除雜菌。之后將勻漿2000 r/min離心5 min，去除上清，得到沉淀[7]。用1 mL生理鹽水混勻后用200目銅網(wǎng)過濾，再加1 mL生理鹽水對銅網(wǎng)進(jìn)行沖洗。將菌液用生理鹽水倍比稀釋為6個(gè)濃度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)，各取100 μL接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6周左右觀察有無菌落生成。其最終小鼠細(xì)菌數(shù)計(jì)算方法為：

細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)×10×稀釋度×2×2。

1.3.4 肺組織病理觀察 取小鼠右肺，福爾馬林溶液固定24 h后，經(jīng)脫水、二甲苯浸潤透明、浸蠟后包埋。切片后進(jìn)行HE染色，二甲苯中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.4 RT-qPCR

1.4.1 設(shè)計(jì)引物 在Pubmed網(wǎng)站上下載EBI3亞基和P35亞基的mRNA序列，用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)qPCR的引物,經(jīng)Oligo Calc驗(yàn)證合理后交由生工公司合成。EBI3基因上游引物：5′-CATTGCCACTTACAGGCTCG-3′，下游引物：5′-TGCAGTGACATTTAGCATGTAGG-3′，擴(kuò)增片段長度139 bp。P35基因上游引物：5′-CAATCACGCTACCTCCTCTTTT-3′，下游引物：5′-CAGCAGTGCAGGAATAATGTTTC-3′，擴(kuò)增片段長度181 bp。內(nèi)參β-actin 基因上游引物:5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物:5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，擴(kuò)增片段長度154 bp。

1.4.2 提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄與qPCR 在十字勻漿器中加入Trizol研磨分離好的50 mg脾臟樣本，經(jīng)三氯甲烷和異丙醇抽提，在4℃離心下沉淀出總RNA。分光光度計(jì)下測定RNA的濃度與純度，A260 /A280 比值在 1.8～2.0則認(rèn)為純度合格，總RNA溶液在-80℃ 保存?zhèn)溆?。根?jù)測得的RNA濃度計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄加入模板量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(TAKARA)嚴(yán)格按照說明書上操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA，置于-20℃?zhèn)溆谩PCR使用ROCHE LightCycler?96擴(kuò)增儀，反應(yīng)體系包含2 μL的引物，10 μL 含有所需離子、酶和SYBR的Master預(yù)混液，1 μL的cDNA模板和7 μL的PCR級的超純水，總體積20 μL。PCR程序如下：95℃ 600 s的預(yù)孵育，95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 12 s 3步45個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物溶解曲線分析程序?yàn)?5℃10 s、65℃ 60 s、97℃ 1 s。結(jié)果使用相對定量方法分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量指數(shù)、脾臟臟器系數(shù)和細(xì)菌計(jì)數(shù)情況 感染4周后可觀察到小鼠毛色干枯，精神萎靡。對外界刺激反應(yīng)遲鈍，飲水飲食量減少。感染8周后小鼠外觀枯瘦虛弱，對外界刺激外應(yīng)微弱。攝食攝水減少。對照組體質(zhì)量指數(shù)高于感染組(P<0.01)，而感染組的脾臟臟器系數(shù)高于對照組(P<0.01)，其中感染8周的小鼠脾臟系數(shù)高于感染4周的小鼠(P<0.01)。感染8周的小鼠肺部細(xì)菌數(shù)目高于感染4周的小鼠(P<0.01)，見表 1。

組別體質(zhì)量指數(shù)脾臟臟器系數(shù)Log10CFU/Lung對照組1.549±0.090.003048±0.00022-感染4周組1.096±0.06?0.005638±0.00099?6.431±0.041感染8周組1.095±0.05?0.011795±0.00083?6.655±0.053F134.125345.923111.723P<0.01<0.01<0.01

*q檢驗(yàn)：與對照組相比，P<0.01。

2.2 肺組織大體標(biāo)本 與對照組小鼠相比，感染組小鼠肺部大體標(biāo)本外觀出現(xiàn)較為密集的大小不等的米白色或淺黃色的圓形或不規(guī)則形狀的顆粒，感染8周組肺組織的顆粒數(shù)量更多且出現(xiàn)有融合更大的顆粒(見圖 1)。

圖1 H37Ra感染后小鼠肺部大體標(biāo)本外觀

2.3 肺組織病理 與對照組小鼠比較，感染4周組小鼠肺部結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，有較為明顯的紅細(xì)胞滲出。相較于對照組小鼠，感染8周組小鼠肺部有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集，而且出現(xiàn)大量的單個(gè)核細(xì)胞浸潤。但是在兩個(gè)感染組中單個(gè)核細(xì)胞并未見生成明顯的朗罕巨細(xì)胞，也未見生成典型的結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死(見圖 2)。

圖2 H37Ra感染后小鼠肺部組織HE染色結(jié)果

2.4 qPCR試驗(yàn) 對qPCR結(jié)果進(jìn)行相對定量分析后發(fā)現(xiàn)，EBI3 mRNA在感染組的表達(dá)高于正常對照組(P<0.01)，其中感染4周組EBI3 mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而感染8周組表達(dá)高于正常對照組和感染4周組。P35 mRNA在感染組的表達(dá)高于正常對照組(P<0.01)，感染8周組表達(dá)水平高于感染4周組(P<0.01)，見表2。

組別EBI3 mRNAP35 mRNA對照組0.873±0.110.724±0.38感染4周組1.600±0.231.792±0.29感染8周組4.638±1.63?4.744±0.78?F156.27844.115P<0.01<0.01

*q檢驗(yàn)：與對照組和感染4周組相比，P<0.01。

3 討論

H37Ra相較于H37Rv菌株毒力較弱[3,8]，在長達(dá)8周的時(shí)間內(nèi)并未在肺部形成典型的結(jié)核病灶，但是在后續(xù)的肺部勻漿培養(yǎng)中證實(shí)了H37Ra菌株可以在肺部定植存在，肺部的炎性細(xì)胞浸潤和病理改變也證實(shí)了H37Ra菌株導(dǎo)致了感染狀態(tài)并且刺激了機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。H37Ra具備了H37Rv的免疫原性，而與BCG相比，H37Ra菌株的免疫原性更為完整[9]，且因致病毒力弱，故用于構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌感染的動(dòng)物模型[3,8]。

本實(shí)驗(yàn)考慮到結(jié)核感染為慢性感染，且H37Ra菌株致病力相較于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv弱，另一方面也考慮到IL-35分子表達(dá)水平升高是一個(gè)逐漸的過程。因此將感染時(shí)間在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下盡量延長至8周，且在第4周時(shí)進(jìn)行中期的對比實(shí)驗(yàn)來揭示目的分子表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。

本實(shí)驗(yàn)采取尾靜脈注射細(xì)菌懸液的方式感染小鼠，雖然與人類在自然條件下通過呼吸道感染結(jié)核分枝桿菌患病有較大區(qū)別，但是血源性的感染可以更好地控制感染效果并且能較準(zhǔn)確地控制感染的劑量。通過結(jié)果可以證實(shí)尾靜脈注射的方式確實(shí)可以使小鼠處于感染狀態(tài)并且產(chǎn)生相應(yīng)的免疫改變。

IL-35是一種負(fù)向調(diào)控的炎癥因子，由iTR35細(xì)胞亞群特異性地產(chǎn)生[5]。在有關(guān)結(jié)核分枝桿菌感染與IL-35的表達(dá)相關(guān)研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:IL-35在結(jié)核菌株感染后其表達(dá)會(huì)呈現(xiàn)不同水平升高[10-12]，同時(shí)有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)IL-35細(xì)胞的表達(dá)與感染模型小鼠的荷菌量呈負(fù)相關(guān)[13]。在本實(shí)驗(yàn)條件下，采用H37Ra菌株感染小鼠后，在4周及8周時(shí)間段其脾組織IL-35表達(dá)升高，且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染8周小鼠脾組織IL-35表達(dá)更高，但肺部細(xì)菌計(jì)數(shù)顯示也更高，筆者認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，要達(dá)到清除細(xì)菌需要免疫功能，特別是細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)，而IL-35表達(dá)的升高，顯示了機(jī)體免疫功能的抑制，故而細(xì)菌在胞內(nèi)依然增殖。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H37Ra菌株感染小鼠相較于正常對照組小鼠脾臟中EBI3和P35 mRNA表達(dá)水平升高，并且在感染8周后更高，提示著IL-35表達(dá)通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能而參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染過程。至于IL-35表達(dá)調(diào)控與結(jié)核分枝桿菌感染的詳盡機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。