田 園,夏梅玲,吳 佳,錢 勇,楊 洲

(上海詩丹德標準技術服務有限公司,上海201314)

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀；Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8μm)色譜柱(沃特世科技有限公司)；Empower 3分析軟件；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；KQ-300DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

西紅花樣品于2017年11月采自于中國上海崇明島廟鎮(zhèn)西紅花種植基地,經本公司楊洲博士鑒定為鳶尾科植物番紅花(CrocussativusL.)的干燥柱頭,保存于上海詩丹德標準技術服務有限公司。

對照品：西紅花苷-Ⅰ(批號：5231)、西紅花苷-Ⅱ(批號：6053)、苦番紅花素(批號：4060)均由上海詩丹德標準技術服務有限公司提供,純度均在98%以上。

乙腈為色譜純(Merck,Darmstadt,Germany),純水為屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司),無水乙醇為分析純(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8μm),柱前連接Waters在線過濾器；流動相：A相為純水,B相為乙腈；流動相梯度為：0～10 min,10%～25%B,10～20min,25%～50%B；柱溫：25℃；進樣量：2μL；流速：0.4m L/min,檢測波長：254 nm、440 nm。

2.2 對照品溶液制備

取西紅花苷-Ⅰ對照品、西紅花苷-Ⅱ對照品和苦番紅花素對照品適量,精密稱定,置于棕色容量瓶中,加稀乙醇分別制成每1m L含西紅花苷-Ⅰ30μg、西紅花苷-Ⅱ12μg和苦番紅花素18μg的混合溶液,即得。

2.3 供試品溶液制備

取西紅花粉末(過三號篩)約10 mg,精密稱定,置于50 m L棕色量瓶中,加稀乙醇適量,置于冰浴中超聲處理30 min,放至室溫,加稀乙醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

3 結果

3.1 專屬性實驗

分別精密吸取空白稀乙醇溶液、供試品溶液和對照品溶液各2μL,注入超高效液相色譜儀,按照“2.1”項下色譜條件進行測定,結果供試品溶液中的待測成分與混合對照品溶液中的色譜峰相對應,空白稀乙醇溶液在相應出峰位置無干擾(見圖1)。由此可以說明,該分析方法的專屬性良好。

有一熟人，平時交往不多，見面只是三言兩語，不咸不淡，但僅僅只是三言兩語都似乎飄忽不定，令人捉摸不透，不知何意，我直覺此人有點“陰”。某一日有人欲加我為QQ好友，觀其頭像乃是此人，看其Q名竟為“鄰術”——不管其本意如何，僅從字面上理解就令我不寒而栗：一個以鄰為壑、與鄰謀“術”之人——敢推心置腹、以誠相待嗎？我毫不猶豫地忽略了這個請求。

圖1 西紅花含量測定UPLC色譜

3.2 線性關系考察

分別精密稱定一定量的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素對照品于棕色量瓶中,加適量稀乙醇溶解定容,配制成混合對照品備用液。其中,混合對照品備用液中各對照品的濃度分別為西紅花苷-Ⅰ48μg/m L、西紅花苷-Ⅱ28.8μg/m L、苦番紅花素60μg/m L。

取上述混合對照品備用液加稀乙醇進行梯度稀釋,稀釋成7個濃度梯度的溶液作為混合對照品溶液,各吸取2 μL混合對照品溶液注入超高效液相色譜儀,按照“2.1”項下色譜條件進行測定。以濃度(μg/m L)(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程,如表1所示。

表1 線性關系試驗結果

3.3 精密度試驗

3.3.1 不同日期精密度試驗 在不同工作日,按照“2.3”項下供試品制備方法分別制備3份供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定西紅花各指標性成分的含量。結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD分別為0.97%、4.76%、3.98%,表明該方法的中間精密度良好。

3.3.2 不同人員精密度試驗 由3位實驗操作者,按照“2.3”項下供試品制備方法分別制備3份供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定西紅花各指標性成分的含量。結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD分別為1.91%、1.83%、2.21%,表明該方法的中間精密度良好。

3.3.3 不同儀器精密度試驗 按照“2.3”項下供試品制備方法分別制備3份供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件在不同儀器上測定西紅花各指標性成分的含量。結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD分別為2.25%、0.77%、0.86%,表明儀器具有良好的精密度。

通過對不同日期、不同人員、不同儀器的精密度考察試驗,結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD均小于5%,表明該方法的精密度良好。

3.4 重復性試驗

按照“2.3”項下供試品制備方法制備6份供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件依次測定西紅花各指標性成分的含量,計算其RSD。結果顯示,西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD分別為1.26%、0.98%、1.85%,表明該方法重復性良好。

3.5 加樣回收率試驗

取已知各指標成分含量的供試品粉末適量,精密稱定,于棕色容量瓶中,分別精密加入相對應量的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素對照品,加入適量稀乙醇,按照“2.3”項下供試品制備方法進行后續(xù)步驟。取制備液作為加樣回收樣品試液,按照按照“2.1”項下色譜條件進行測定,計算西紅花各指標性成分的回收率及RSD,結果見表2。

3.6 穩(wěn)定性試驗

取西紅花供試品粉末適量,按照“2.3”項下供試品制備方法制備供試品溶液,4℃放置。分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24 h、48 h、96 h注入超高效液相色譜儀,按照“2.1”項下色譜條件依次測定西紅花各指標性成分的含量,計算其RSD。結果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素含量的RSD分別為1.71%、1.27%、2.85%,表明西紅花各指標性成分在4℃下96 h內穩(wěn)定性良好。

表2 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素加樣回收率試驗結果

3.7 樣品含量測定

取21批不同產地來源的西紅花藥材,按照“2.3”項下供試品制備方法制備供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定西紅花各指標性成分的含量,結果見表3。

4 討論

4.1 測定波長選擇

采用PDA檢測器于210～500nm波長范圍內對西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素對照品溶液進行紫外掃描。結果顯示,苦番紅花素在254nm處有最大吸收,西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ在440 nm處有最大吸收[15-18]。由于西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素的最大吸收波長不同,難以在同時兼顧到所有測定成分的某單一波長處進行檢測。因此,本實驗采用UPLC波長切換法同時測定西紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和苦番紅花素的含量。選擇0～6min時在254nm波長下檢測苦番紅花素；在6～20 min時在440 nm波長下檢測紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ。

4.2 提取時間選擇

通過考察不同超聲提取時間(15 min、20 min、30 min、40 min)對西紅花各指標性成分含量的影響,發(fā)現當提取時間為30min時,西紅花各指標性成分的含量不會再隨超聲提取時間的增長而增加,表明樣品已基本提取完全,因此選擇30 min為最佳提取時間。

4.3 流動相選擇

通過考察不同流動相比例(乙腈比例變化±10%)對西紅花各指標性成分含量的影響,結果表明流動相(乙腈)比例在一定范圍內有微小變動時對該方法幾乎沒有影響。

4.4 柱溫選擇

通過考察不同柱溫(23℃、25℃、27℃)對西紅花各指標性成分含量的影響,結果表明柱溫在一定范圍內有微小變動時對該方法基本沒有影響,本研究選擇25℃作為含量測定時的柱溫。

4.5 流速選擇

通過考察不同流速(0.35 m L/min、0.40 m L/min、0.45 m L/min)對西紅花各指標性成分含量的影響,結果表明,不同流速對樣品的保留時間和分離度具有明顯影響,當流速為0.4 m L/min時,西紅花各指標性成分的分離度最大,因此本研究流速選擇0.4 m L/min。

4.6 含量測定分析

通過對21批不同產地來源西紅花各指標性成分進行含量測定,實驗結果顯示,各批西紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量之和均超過2015版藥典中不得小于10%的標準,均符合藥典要求。不同來源的西紅花中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量之和及苦番紅花素的含量差異顯著,國內來源(如上海、河北、浙江、安徽等地)的西紅花中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量之和及苦番紅花素的含量稍高于國外來源(如伊朗、巴基斯坦等地)的西紅花；以上海和浙江產的西紅花中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量之和及苦番紅花素的含量最高,其原因可能與西紅花產地、采收時間及加工儲存方式等因素有關,具體原因有待進一步研究。

表3 西紅花指標成分含量測定結果 (%)

本文采用UPLC波長切換法同時測定不同產地西紅花藥材中苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量,初步認為,該方法在操作上簡便快捷、專屬性良好、重復性好、精密度高且易于在生產、流通和使用環(huán)節(jié)中普遍應用。該方法在《中國藥典》測定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量的基礎上,增加苦番紅花素的含量測定,能夠更全面體現西紅花中主要成分的含量,可為西紅花質量控制提供更加精確量化的依據,也為其生產流通中的質量監(jiān)控提供了一定的科學參考。