姚榮妹，毛鑫，包蕾，高英杰，王彥禮，崔曉蘭

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

艾康片是由川芎、茯苓、靈芝、金銀花、野菊花、苦參、甘草等13味藥組成的中藥復(fù)方，我們前期對(duì)其進(jìn)行了大量的中藥組方篩選和藥理藥效研究，發(fā)現(xiàn)艾康片可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，在抗腫瘤(肺)方面表現(xiàn)出很好的藥效作用。提取工藝是中藥復(fù)方制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響臨床療效，為進(jìn)一步篩選艾康片最佳的工藝提取方法，我們根據(jù)其臨床適應(yīng)癥設(shè)計(jì)了相應(yīng)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，為其進(jìn)一步工藝路線的確定和工藝參數(shù)的選擇提供參考。本實(shí)驗(yàn)利用裸小鼠建立移植性肺癌動(dòng)物模型[1-3]，結(jié)合體內(nèi)抗腫瘤的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法，觀察艾康片3種提取工藝在抑制肺部腫瘤生長(zhǎng)方面的效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

BALB/CA-nu品系的裸小鼠，體質(zhì)量(19±1)g，雌雄各半，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。A549人小細(xì)胞肺癌傳代細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品及試劑

艾康片提取物，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥制劑研究中心提供，批號(hào)：20160912-1、20160912-2、20160912-3，規(guī)格：200 mL/瓶；復(fù)方環(huán)磷酰胺片，購(gòu)自通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：160702。PBS磷酸緩沖液(美國(guó)Gibco，批號(hào)1789842)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco，批號(hào)8116489)；胎牛血清(美國(guó)Gibco，批號(hào)1390781)；雙抗(美國(guó)Hyclone，批號(hào)J130061)；0.25%胰酶(美國(guó)Gibco，批號(hào)1616025)。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific，Thermo-371)；潔凈工作臺(tái)(美國(guó)AIRTECH，SW-CJ-2FD)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，5810R)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，CKX41)；高溫蒸汽滅菌器(ALP，CLG-32L)；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，countstar-IC1000)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204)；數(shù)顯卡尺(上海恒勝工具有限公司，METR-ISO)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 劑量設(shè)計(jì)

艾康片成人臨床推薦劑量為7.6 g生藥/60(kg·d)，換算成裸小鼠等效用量為1.4 g/(kg·d)。實(shí)驗(yàn)中采用2.8、1.4、0.7 g/(kg·d)3個(gè)劑量組(分別相當(dāng)于人臨床用量的2倍、等倍、1/2倍)。該藥3種提取工藝含藥量均為2 g生藥/mL，故3種提取物高、中、低劑量為1.4 mL/(kg·d)、0.7 mL/(kg·d)、0.35 mL/(kg·d)。復(fù)方環(huán)磷酰胺片成人臨床推薦劑量175 mg/60(kg·d)，實(shí)驗(yàn)中小鼠用量按人用量的11倍計(jì)算，小鼠的給藥劑量為32 mg/(kg·d)。

2.2 人肺腺癌細(xì)胞株(A549)的培養(yǎng)

細(xì)胞株培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液， 37℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化，離心后傳代，待細(xì)胞培養(yǎng)至一定數(shù)量，用PBS稀釋成腫瘤細(xì)胞懸液接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。

2.3 細(xì)胞體外活性檢測(cè)及腫瘤細(xì)胞懸浮液的制備

在無菌條件下取生長(zhǎng)良好的A549腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化、離心后，用PBS混懸細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法，使用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)。用PBS稀釋成2×107個(gè)細(xì)胞/mL濃度的腫瘤細(xì)胞懸浮液。

2.4 制備人肺癌移植瘤模型

在無菌條件下，將裸鼠用75%乙醇皮膚消毒后，在裸鼠右腋皮下接種人肺腺癌A549細(xì)胞懸液，0.2 mL/只，接種后定期觀察小鼠的精神、飲食及排便等情況。接種1周左右，可見接種部位皮下長(zhǎng)出小米粒大小的硬結(jié)，為移植瘤模型建成。

2.5 分組及給藥

待腫瘤生長(zhǎng)至100 mm3左右，挑選瘤塊、體質(zhì)量均勻的裸小鼠，隨機(jī)分為11組，分別為模型對(duì)照組、環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組、艾康1號(hào)高、中、低3個(gè)劑量組、艾康2號(hào)高、中、低3個(gè)劑量組、艾康3號(hào)高、中、低3個(gè)劑量組，每組7只，分組當(dāng)天開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)21 d，給藥容積為0.2 mL/10 g。

2.6 觀察指標(biāo)及計(jì)算方法

平均瘤重、腫瘤生長(zhǎng)抑制率、腫瘤體積、相對(duì)腫瘤體積、相對(duì)腫瘤增殖率。

腫瘤體積(tumor volume,TV)：TV=1/2×a×b2或π/6×a×b×c，其中a、b、c分別表示長(zhǎng)寬高。

相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)：RTV=Vt/V0，其中V0為給藥前測(cè)量所得腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)：T/C%=TRTV/CRTV×100%，(TRTV為治療組RTV；CRTV為陰性對(duì)照組RTV)。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長(zhǎng)情況的影響

艾康片3種工藝樣品在給藥2 d后起腫瘤體積與模型對(duì)照組比較均有所下降，給藥組裸鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)曲線均位于模型對(duì)照組下方。2號(hào)、3號(hào)樣品在給藥8～20 d后腫瘤體積與模型對(duì)照組比較明顯下降(P<0.01,P<0.05)，1號(hào)樣品在給藥12～20 d后腫瘤體積與模型對(duì)照組比較明顯下降(P<0.01,P<0.05)，其中3號(hào)藥品中劑量組腫瘤體積在給藥4～20 d后5個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與模型對(duì)照組比較均有差異(P<0.01)，從數(shù)值上看差異也最為顯著。(見表1、圖1)。

圖1 艾康片治療后腫瘤體積生長(zhǎng)曲線

圖2 艾康片對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠相對(duì)腫瘤增殖體積的影響

3.2 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠相對(duì)腫瘤增殖體積(RTV)及相對(duì)腫瘤增殖率的影響

艾康3號(hào)中劑量組的相對(duì)腫瘤增殖體積在給藥期間與模型對(duì)照組比較有差異(P<0.05)，其余各用藥組與模型組無差異。與模型對(duì)照組比較，艾康1號(hào)高劑量組、艾康2號(hào)高劑量組、艾康3號(hào)中劑量組的相對(duì)腫瘤增殖率在28%～70%之間，艾康1號(hào)中劑量組和艾康1號(hào)低劑量組相對(duì)腫瘤增殖率在給藥前16 d均高于模型組，其余用藥組的相對(duì)腫瘤增殖率在50%～90%之間。見圖2、圖3。

3.3 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠相對(duì)腫瘤重量的影響

艾康片各劑量組瘤塊重量與模型對(duì)照組比較均有差異(P<0.01)，艾康3號(hào)中劑量組腫瘤塊重量最小,見表2。

表1 艾康片對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長(zhǎng)情況的影響

續(xù)表1 艾康片對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長(zhǎng)情況的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 艾康片對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠相對(duì)腫瘤增殖率的影響

表2 艾康片對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤重量的影響

注：與模型對(duì)照組比較，**P<0.01

4 討論

肺癌已成為世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率還在持續(xù)增加[4-6]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署2015年發(fā)布的GLOBOCAN癌癥報(bào)告顯示，預(yù)測(cè)到2025年，中國(guó)每年新增肺癌病例將超過100萬，將成為全球肺癌患者最多的國(guó)家。因此，抗肺癌藥物的研究開發(fā)在我國(guó)顯得尤為迫切，也是為當(dāng)前的科研熱點(diǎn)之一。中國(guó)是天然藥物資源大國(guó)，從積累了數(shù)千年臨床經(jīng)驗(yàn)的中草藥寶庫(kù)中發(fā)掘有效的抗腫瘤新藥是我國(guó)醫(yī)藥界的重要研究方向。艾康片從經(jīng)典古方化裁而來，方中川芎之類活血通脈，茯苓之類補(bǔ)肺脾，靈芝補(bǔ)氣安神，金銀花、野菊花之類清熱解毒，甘草調(diào)和以上藥物的烈性兼?zhèn)渲雇垂π?，諸藥合用共奏活血化瘀、補(bǔ)氣寧心、清熱解毒、滋補(bǔ)強(qiáng)身之功，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，改善機(jī)體不適癥狀，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

將人類肺癌細(xì)胞系移植到免疫缺陷動(dòng)物皮下是對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究的首選方法[7]。裸鼠移植性肺癌動(dòng)物模型是把肺癌組織塊或肺癌細(xì)胞系接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)形成的荷瘤動(dòng)物模型，主要包括異位移植、原位移植和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型三類。目前常用的肺癌細(xì)胞系包括人肺腺癌A549、SPC-A-1、Calu-3、LTEP-a-2、人肺扁平上皮癌QG-56、人高轉(zhuǎn)移肺癌95-D、人肺癌大細(xì)胞系NCI-H460以及人肺癌小細(xì)胞系NCI-H446等[8]。本研究在裸小鼠右腋皮下接種人肺腺癌A549細(xì)胞懸液制備肺癌移植瘤模型，觀察艾康片3種提取物的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種提取樣品均有降低裸鼠腫瘤體積、相對(duì)腫瘤增殖體積、腫瘤增殖率、腫瘤重量的作用，其中3號(hào)樣品中劑量組腫瘤體積明顯減小，是僅有的在相對(duì)腫瘤增殖體積方面與模型對(duì)照組比較有差異的用藥組，其相對(duì)腫瘤增殖率在給藥8 d后在40%以下，且瘤塊重量最小。上述藥效學(xué)研究數(shù)據(jù)提示，3號(hào)樣品制劑在抑制腫瘤方面有效、劑型合理，且未表現(xiàn)出明顯毒副作用，該樣品的提取工藝有推廣應(yīng)用價(jià)值。