周瀲，彭皖蘇，周夢(mèng)圓，蔣佳風(fēng),徐萍,譚城*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

白癜風(fēng)是一種易診難療的色素減退疾病，自古以來，世界各個(gè)國(guó)家運(yùn)用不同性質(zhì)和效果的草藥提取物治療色素性疾?。恒y杏葉提取物、甜瓜、阿米芹種子提取物凱林、阿育吠陀醫(yī)學(xué)中胡黃連、水龍骨提取物(青蓮提取物)、綠茶多酚、辣椒素、姜黃色素、橙色喇叭花以及傳統(tǒng)中醫(yī)中藥[1]。隨著社會(huì)進(jìn)步和信息化的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)中藥治療已經(jīng)走出國(guó)門，被全世界認(rèn)可和接受:通過結(jié)合局部或全身UVA光照與補(bǔ)骨脂種子提取物聯(lián)合運(yùn)用的治療方法(PUVA療法)其作用機(jī)制及其療效已被國(guó)際社會(huì)認(rèn)可[1]。不僅僅是單味中藥，中醫(yī)還曾嘗試用不同的復(fù)方草藥產(chǎn)品治療白癜風(fēng)。用于白癜風(fēng)的復(fù)方外用制劑治療也已經(jīng)在體內(nèi)和體外獲得了明確的藥物功效。特別是祖國(guó)醫(yī)學(xué)分支維吾爾醫(yī)學(xué)中最常用的白癜風(fēng)治療方“Barres復(fù)方”。該制劑由五種草藥(補(bǔ)骨脂、白花丹、薺菜、黑種草和驅(qū)蟲斑鳩菊)的高溫水提取物組成[2]。 在國(guó)外最新兩項(xiàng)研究中表明其復(fù)方干預(yù)的白癜風(fēng)皮損創(chuàng)面已經(jīng)觀察到良好的色素沉著和復(fù)色，推測(cè)其能刺激黑素細(xì)胞的黑素生成[3]。瘡靈液也是一種純中藥外用藥液，功效為活血化瘀、解毒，收斂生肌,由南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院即江蘇省中醫(yī)院在上世紀(jì)80年代研制，主要由大黃、紅花、訶子、黃蜀葵花等組成，全方配伍，具有化瘀活血、收斂生肌、止痛消腫之效，符合中醫(yī)治療白癜風(fēng)補(bǔ)益肝腎、活血化瘀為主的治療大法。瘡靈液安全性能較好，無毒無肝損，高效抗炎，對(duì)各種慢性潰瘍及潰瘍伴有炎癥療效顯著[4]。臨床觀察到瘡靈液治療后的創(chuàng)面皮損色素有所加深，療效類似于近期對(duì)于“Barresi復(fù)方”的研究推測(cè)也有增加人黑素細(xì)胞的黑素合成的可能性,因而研究了瘡靈液對(duì)鼠永生化黑素細(xì)胞的作用，希望拓寬外用藥的適應(yīng)范圍，為其治療白癜風(fēng)等皮膚科疾病、走向國(guó)際醫(yī)學(xué)界提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

參照文獻(xiàn)[5]，瘡靈液原液(江蘇省中醫(yī)院研發(fā)自制，批號(hào)：1501001):設(shè)原液為1 g/mL，過濾除菌后分裝于15 mL離心管中，并置于-20℃存放待用，使用前完全培養(yǎng)液稀釋。完全培養(yǎng)液：F10培養(yǎng)液(Gibco)中加入59 ng/mL TPA(碧云天生物)及7%的馬血清(Gibco)，混勻后于4℃存放。1% TritonX-100溶液：5 mL的PBS(Hyclone)溶液吸棄50 μL等體積加入50 μL TritonX-100，配制成5 mL的1%TritonX-100溶液。L-Dopa溶液：少量L-Dopa(Sigma)1M稀HCl溶解繼續(xù)用 PBS溶液稀釋，配平L-Dopa濃度至2 g/L。10%DMSO-NaOH溶液配制：2 gNaOH(Sigma)用ddH2O50 mL稀釋到1 mol/L，棄去5 mL后等體積加入5 mLDMSO溶液，混合成含10%DMSO-NaOH混合液。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

凍存的鼠永生化黑素細(xì)LIOBIOBR-GFP(ATCC?CRL-2770TM)于恒溫水浴箱中快速融化，然后室溫低速離心機(jī)1 100 r/min離心6 min，加入5 mL完全培養(yǎng)液，吹打混勻后，種于10 cm培養(yǎng)皿，然后移入培養(yǎng)箱，第二天，倒置顯微鏡40倍鏡下觀察細(xì)胞貼附及生長(zhǎng)狀態(tài)，若細(xì)胞狀態(tài)良好，此后約2 d換1次培養(yǎng)液[5]。細(xì)胞長(zhǎng)到皿底60%面積后傳代，按1∶3比例，傳代后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育，待3～4代時(shí)取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 干預(yù)分組

從培養(yǎng)箱中取出傳代完的黑素細(xì)胞，先用無菌PBS液清洗2遍，后吸出PBS加入1 mL胰蛋白酶，1 min后消化完全后加入完全培養(yǎng)液2 mL終止消化，吸入離心管, 置于常溫低速離心機(jī)1 100 r/min離心5 min，1 mL移液器混勻，取10 μL加入10 μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后于自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板上機(jī)計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度到5×104/mL，每孔100 μl種到96孔板，培養(yǎng)箱繼續(xù)培育[5]。瘡靈液按比例加完全培養(yǎng)液稀釋，將其分別配制成50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL的相應(yīng)溶液備用。24 h后吸出96孔板中的液體，加入各濃度的瘡靈液，單獨(dú)設(shè)一組無藥物的孔為空白對(duì)照孔，每一組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后結(jié)束干預(yù)(黑素細(xì)胞形態(tài)見圖1～8)。

圖1 未給藥6孔板內(nèi)黑素細(xì)胞(×40)

圖2 6孔板空白對(duì)照組黑素細(xì)胞(培養(yǎng)72 h后，×40)

圖3 6孔板(50 μg/mL)藥物劑量干預(yù)72 h黑素細(xì)胞(×40)

圖4 6孔板(100 μg/mL)藥物劑量干預(yù)72 h黑素細(xì)胞(×40)

圖5 6孔板(400 μg/mL)藥物劑量干預(yù)72 h黑素細(xì)胞(×40)

圖6 6孔板(800 μg/mL)藥物劑量干預(yù)72 h黑素細(xì)胞(×40)

圖7 6孔板(1 600 μg/mL)藥物劑量干預(yù)72 h黑素細(xì)胞(×40)

圖8 6孔板(3 200 μg/mL)藥物劑量干預(yù)后黑素細(xì)胞(×40)

1.2.3 黑素細(xì)胞增殖率的測(cè)定

采用MTT法測(cè)定其值。96孔板每孔分別加入50 μL1倍MTT溶液，放入37℃恒溫箱，4 h后小心棄去液體后每孔加入100 μL DMSO后放入搖床充分振蕩，10 min后待晶體溶解，置于酶標(biāo)儀(預(yù)設(shè)490 nm)測(cè)量其吸光值[5]。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞增殖率結(jié)果等于加藥組平均吸光值/空白組對(duì)照組吸光值(百分?jǐn)?shù))。

1.2.4 酪氨酸酶活性測(cè)定

96孔板棄掉液體，無菌PBS沖洗2遍后每孔加入l%TritonX-100試劑90 μL，然后放置于-80℃超低溫冰箱中反應(yīng)，30 min后，取出待其恢復(fù)到室溫，每孔加入L-DOPA溶液10 μg，再放入37℃溫箱中充分反應(yīng)90 min，取出于酶標(biāo)儀測(cè)吸光值(475 nm波長(zhǎng))[5]。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。酪氨酸酶活性比率等于加藥組平均吸光值/空白對(duì)照組平均吸光值(百分?jǐn)?shù))。

1.2.5 細(xì)胞黑素含量測(cè)定

6孔板吸棄液體，無菌PBS沖洗2遍，每孔加入胰蛋白酶200 μL充分消化，培養(yǎng)液終止消化后1 100 r/min離心5 min，再加入PBS溶液繼續(xù)沖洗2遍沉淀。再加入配好的NaOH溶液，每管300 μL[5]。金屬浴100℃加溫30 min后冷卻至常溫，溶液混勻后移入96孔板中，放入酶標(biāo)儀測(cè)吸光值(490 nm)，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次[5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)黑素按不同濃度加入96孔板測(cè)得黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光值帶進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出黑素濃度值(mg/mL)，黑素含量結(jié)果等于加藥組黑素濃度/空白對(duì)照組平均濃度(百分?jǐn)?shù))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0軟件處理并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)方差齊性后采用單因素方差分析比較差異性。結(jié)果若P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，P<0.01是認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 瘡靈液對(duì)于黑素細(xì)胞的增殖作用

由表1和圖9可知，瘡靈液低濃度(50 μg/mL)P值>0.05，高濃度(3 200 μg/mL)P值>0.05，說明最高和最低濃度的瘡靈液對(duì)細(xì)胞增殖無顯著作用;瘡靈液濃度在100～1 600 μg/mL時(shí)，有增進(jìn)黑素細(xì)胞生殖的作用(P值均<0.05)，而且在100～400 μg/mL時(shí)，其作用成劑量依賴性遞增，在400 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值。

表1 各濃度瘡靈液對(duì)黑素細(xì)胞增殖的作用

圖9 各濃度瘡靈液對(duì)黑素細(xì)胞增殖的作用

2.2 瘡靈液對(duì)黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的作用

由表2及圖10可見，當(dāng)為50 μg/mL(低干預(yù)濃度)，與空白組相比，黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性(P值>0.05)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)酪氨酸活性無明顯作用；瘡靈液濃度在≥100 μg/mL(高干預(yù)濃度)，均對(duì)酪氨酸酶活性有所增加(P值均<0.05)。特別在濃度在400 μg/mL以上，P值均<0.001，酪氨酸酶的活性顯著增強(qiáng)。圖10可見其對(duì)酪氨酸酶活性的影響大致也呈劑量依賴性遞增。

表2 各濃度瘡靈液對(duì)酪氨酸酶活性的作用

圖10 各濃度瘡靈液對(duì)酪氨酸酶活性的作用

2.3 瘡靈液對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成的作用

由表3及圖11可見，50 μg/mL(低干預(yù)濃度)時(shí)，與空白組相比，黑素細(xì)胞黑素含量(P>0.05)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，瘡靈液在低濃度溶液對(duì)黑素細(xì)胞黑素生成無顯著作用；在≥100 μg/mL(高干預(yù)濃度)時(shí)，(P<0.05)差異顯著，黑素細(xì)胞的黑素合成均有所增加。

表3 各濃度瘡靈液對(duì)細(xì)胞黑素含量的作用

圖11 各濃度瘡靈液對(duì)黑素含量的作用

3 討論

白癜風(fēng)影響世界0.5%的人口，是種后天慢性的損容類皮膚科疾病。白癜風(fēng)以斑片狀脫色為特征，其特點(diǎn)在于表皮和皮膚其他組織中的黑素細(xì)胞全部或部分喪失，功能性黑素細(xì)胞喪失的主要病理生理學(xué)原因被認(rèn)為包括遺傳易感性，自身免疫機(jī)制和氧化應(yīng)激[6]。目前的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療選擇主要基于三種方法：(1)使用局部和全身免疫調(diào)節(jié)劑(主要是皮質(zhì)類固醇和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑)調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng); (2)通過局部和全身抗氧化劑降低黑素細(xì)胞中的氧化應(yīng)激;(3)使用光療法(特別是UVB)和色素細(xì)胞移植激活黑素細(xì)胞再生[6]。白癜風(fēng)一般呈慢性發(fā)病，病程較長(zhǎng)，雖不影響患者生理健康，但其皮膚脫色的特征通常導(dǎo)致美容缺陷和患者相當(dāng)大的心理困擾或心理問題，臨床研究表明某些白癜風(fēng)患者社會(huì)接受度降低的風(fēng)險(xiǎn)較高，生活質(zhì)量也隨之降低，可以推斷這些患者更需要積極治療該疾病,以提高其生活質(zhì)量和社會(huì)接受度[7]。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)中藥治療白癜風(fēng)機(jī)制的研究，各種中藥外用制劑被開發(fā)出來。張春艷，許愛娥[8]根據(jù)中藥的療效、四氣五味、歸經(jīng)所屬和現(xiàn)代臨床藥理學(xué)研究成果，對(duì)以往文獻(xiàn)中近30年來治療白癜風(fēng)的常用外用方藥進(jìn)行總結(jié)，統(tǒng)計(jì)得出結(jié)果: 補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥、酪氨酸激活藥、光敏感藥在外用治療白癜風(fēng)中最常用。酪氨酸酶濃度及活性大小干預(yù)著黑素細(xì)胞中合成的黑素含量的多少，是黑素合成中關(guān)鍵的限速酶[9]。通過實(shí)驗(yàn)在臨床活血化瘀方藥中遴選出增加黑素生成的中藥具有潛在的應(yīng)用。瘡靈液，是一種主要由大黃、訶子、紅花、黃蜀葵花組成的外用中藥制劑。許振毅[10]等研究得出大黃三種有效成分對(duì)酪氨酸酶的調(diào)節(jié)呈雙向作用：蘆薈大黃素(低劑量)提高細(xì)胞70%的酪氨酸酶活性，大黃次酸(高劑量)提高了細(xì)胞81%的酪氨酸酶活性，大黃素甲醚對(duì)酪氨酸酶的活性促進(jìn)作用呈濃度依賴性。張理平[11]確定了酸性中藥中28味成分提取物對(duì)黑素合成影響，其中訶子對(duì)酶活性影響呈在高濃度溶液時(shí)抑制，中、低濃度增加的雙向作用。紅花是傳統(tǒng)中醫(yī)常用的活血化瘀藥，姜麗莎[12]等用主要成分為紅花的院內(nèi)自制擦劑干預(yù)豚鼠模型，結(jié)果顯示復(fù)方紅花酊高至中劑量治療組有明顯療效，其機(jī)理可能是令一種重要的前炎性細(xì)胞因子TNF-α和免疫相關(guān)連的白介素因子IL-10的表達(dá)上升，進(jìn)一步促進(jìn)黑素合成和免疫抗氧化的調(diào)節(jié)來達(dá)到皮損色素沉著和復(fù)色的治療目的。

氧化應(yīng)激也是白癜風(fēng)生成的重要病理機(jī)制，氧化應(yīng)激可能觸發(fā)通過黑素細(xì)胞自分泌釋放HMGB1(一種晚期炎癥介質(zhì))，抑制黑素細(xì)胞的表達(dá)Nrf2(一種保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的關(guān)鍵因素)和下游抗氧化應(yīng)激基因，直接或間接導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡，參與白癜風(fēng)的病理發(fā)病過程[13]。黃蜀葵花提取物具有良好的抗氧化性能和防止細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷功能，黎望[14]研究顯示黃蜀葵花的主要成份黃酮類物質(zhì)在0.04至0.60 mg/mL濃度時(shí)，對(duì)-OH 和H2O2導(dǎo)致的DNA氧化損傷都能起到保護(hù)作用，在0.12 mg/mL濃度時(shí)，對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)。由此推測(cè)黃蜀葵花可能作用于白癜風(fēng)氧化應(yīng)激的病理機(jī)制以達(dá)到治療的療效。

綜上，瘡靈液的幾種成分均有相關(guān)文獻(xiàn)研究支持，理論上我們推測(cè)其可以從不同機(jī)制作用于黑素細(xì)胞達(dá)到治療白癜風(fēng)的效果。此前，瘡靈液主要運(yùn)用在促進(jìn)創(chuàng)口愈合：許巖磊[15]等研究出瘡靈液可以減少潰瘍處炎癥相關(guān)蛋白酶釋放的同時(shí)增強(qiáng)組織基質(zhì)生成的作用機(jī)理。張媞[16]等研究了瘡靈液外用促進(jìn)漿細(xì)胞性乳腺炎傷口愈合的療效，得出瘡靈液能夠可以降低潰瘍面IL-2、IL-4、IL-6等炎癥因子從而減損傷處炎性癥狀,緩解疼痛,改善局部皮損病理和皮膚生理,減小腫塊大小從而幫助組織再生。至今為止，在基礎(chǔ)研究方面，瘡靈液用于白癜風(fēng)治療存在空白。臨床中我們觀察到瘡靈液治療后的創(chuàng)面，不但愈合良好，甚至有些原皮損處色素有所加深。根據(jù)臨床現(xiàn)象作者研究了瘡靈液干預(yù)后，小鼠永生化黑素細(xì)胞(ATCC?CRL-2770TM)增殖率，酪氨酸酶活性以及黑素合成的改變，研究得出瘡靈液對(duì)此三項(xiàng)指標(biāo)均有增進(jìn)作用。所以作者推測(cè)在黑素細(xì)胞黑素合成方面瘡靈液對(duì)鼠永生化細(xì)胞具有一定的增進(jìn)作用。本研究為瘡靈液用于治療白癜風(fēng)等色素減退性疾病提供了理論依據(jù)，不足之處如：具體作用機(jī)制、有效成分及其劑量尚待進(jìn)一步研究。