馮茜　國巍　燕紅

摘要：為分離篩選出能高效降解木質(zhì)素的絲狀真菌，構(gòu)建生物固定化載體，從造紙廠采集的污泥中分離篩選出一株高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的真菌G?13，其產(chǎn)錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶的活力分別為8?27、0?95和13?55.U/L。通過對菌絲成球影響因素的研究，得到最佳成球條件：18.g/L的蔗糖和2?5.g/L酒石酸銨分別為最佳碳源和氮源，培養(yǎng)基的pH值為5，將5.mL菌懸液接種于100.mL成球液體培養(yǎng)基（250.mL錐形瓶）中，160.r/min，30℃培養(yǎng)72.h，得到的菌絲球球徑最大，約為3?4.mm，且表面光滑，彈性好，內(nèi)部中空，是一種優(yōu)良的生物固定化載體，能夠滿足實踐應用的需求。

關(guān)鍵詞：

木質(zhì)素;煙曲霉菌;菌絲球;條件優(yōu)化;生物載體

DOI：10.15938/j.jhust.2019.01.023

中圖分類號： Q939?9

文獻標志碼： A

文章編號： 1007-2683（2019）01-0138-07

Isolation and Screening of the Lignin?degrading Fungusand

Optimization of the Mycelium Pellet Cultivation Conditions

FENG Qian?1， 2?，GUO Wei?1，2?，YAN Hong?1，2

（1?School of Chemical and Environmental Engineering， Harbin University of Science and Technology， Harbin 150040， China;

2?Key Laboratory of Green Chemical Technology of College of Heilongjiang Province， Harbin 150040， China）

Abstract：In order to isolate andscreen microorganisms that could degrade ligninefficiently， and then constructbiological immobilization carrier， there was 1 strain of high effcient lignin?degrading fungi， named G?13， isolated from the sludge samples collected by the paper mill， which the highest lingin enzyme activity of manganese peroxidase（MnP）， laccase（Lac） and lignin peroxidase（LiP） were 8?27， 0?95 and 13?55.U/L， respectively?Through the study of factors that can affect the pelletization， the best conditions are as follows： sucrose concentration of 18.g/L and ammonium tartrate concentration of 2?5.g/L were worked as the best carbon source and nitrogen source， respectively; the most appropriate medium pH was 5; 5.mL of spore suspension was inoculated on 100.mL of liquid medium forpelletization （in 250.mL Erlenmeyer flask）;the optimum temperature was 30℃; and the most suitable shaker speed was 160.r/min?Cultured under the most suitable growing conditions for 72.h， the mycelium pellet formed by Aspergillus fumigatus G?13 reached its maximum diameter of 3?4.mm with smooth surface， excellent flexibility and hollow structure， which can be used as biological immobilization carrier as wellas meets the needs of practical application such as industrial wastewater treatment

Keywords：

lignin; Aspergillus fumigatus; mycelia pellets;condition optimization; biological carrier

0引言

制漿造紙工業(yè)每年要從植物中分離出大約14億t纖維素，同時產(chǎn)生含有?5.000?萬t左右木質(zhì)素的污水[1]。木質(zhì)素（Lignin）是高等植物大量含有的有機高分子化合物，其結(jié)構(gòu)復雜，降解困難，95%的木質(zhì)素仍以造紙廢水的形式直接排入江河或濃縮后燒掉，這不僅浪費了木質(zhì)素這一重要的可再生資源，還對環(huán)境造成了嚴重污染[2-8]。因此，高效利用可再生資源木質(zhì)素，并解決制造紙廢液引發(fā)的環(huán)境污染問題受到科學研究工作者的極大關(guān)注[9-12]。在造紙工業(yè)污水處理系統(tǒng)中，應用微生物降解木質(zhì)素的關(guān)鍵問題是防止工程菌的流失。菌絲球（pellet）是真菌在液體培養(yǎng)過程中，由菌絲纏繞而形成的一種中空的微生物顆粒，它生存能力較強，具有生物活性良好、沉降速度快、易于固液分離，可實現(xiàn)重復利用等特點[13-15]。且形絲球的微生物還成菌能正常生長，具有產(chǎn)酶、代謝等功能，可保留包括生物吸附和生物降解等在內(nèi)的生物活性[1]?；诖苏婢z球在去除難降解物質(zhì)、進行染料脫色、吸附重金屬離子等方面表現(xiàn)出了很廣泛的應用價值[16-19]，利用菌絲球作為自固定化細胞體系[20]，為這一難題的解決提供了新的思路和方法。

1材料與方法

1?1材料

1?1?1樣本來源

研究所用的污泥樣本共10份，于2014年10月采自黑龍江省方正縣高楞造紙廠。

1?1?2培養(yǎng)基

1）PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.g，葡萄糖20.g/L，KH?2?PO?4?3.g/L，MgSO4·7H?2?O 1?5.g/L，瓊脂20.g/L，微量VB?1?，加蒸餾水配成?1.000?mL，pH值自然，120℃滅菌20.min。

2）GU?PDA平板培養(yǎng)基：于PDA培養(yǎng)基加入0?1%的愈創(chuàng)木酚。

3）液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：NH?4?Cl 1.g/L，KH?2?PO?4?1.g/L，MgSO?4?·7H?2?O 0?5.g/L，蔗糖10.g/L，加蒸餾水配成?1.000?mL，pH值自然，120℃滅菌20.min。

4）菌絲球成球培養(yǎng)基：葡萄糖10.g/L，NH?4?Cl?2.g/L，?KH?2?PO?4?2.g/L，MgSO?4?·7H?2?O 2.g/L，加蒸餾水配成?1.000?mL，pH值自然，120℃滅菌20.min。

1?1?3試驗器材

TYXQ?LS?75S型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）、SW?CJ?1FD潔凈臺（上海博訊實業(yè)有限公司）、GZX?9070MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）、XSP?2CA光學顯微鏡（上海辰華）、SHZ?82A 氣浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司）、SHZ?A水浴恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司）、電子分析天平（常熟市天量儀器有限責任公司）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任）。

1?2方法

1?2?1菌株的分離純化

稱取5.g污泥樣品，加入到經(jīng)過高溫滅菌的裝有30.mL 0?9%的生理鹽水和玻璃珠的250.mL錐形瓶中，振蕩搖勻后，進行逐級稀釋。取出0?3.mL逐級稀釋后的菌液涂布于PDA培養(yǎng)基的平板中央，于30℃恒溫培養(yǎng)120.h，挑取單一菌落劃線培養(yǎng)于分離平板，經(jīng)多次劃線分離純化，同時結(jié)合顯微鏡鏡檢觀察，獲得的真菌純培養(yǎng)物劃線于斜面培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)5.d后，保存于4℃冰箱中。

1?2?2菌株的初篩

用接菌環(huán)取一環(huán)已經(jīng)分離純化的真菌培養(yǎng)物點樣到GU?PDA平板上，每株菌分別點兩個平皿，且于每個平皿中點4個樣，30℃恒溫培養(yǎng)7.d。觀察菌落顏色和形狀的變化情況，對于產(chǎn)生變色圈的菌株，分別測定其菌絲圈、變色圈的直徑，并計算其平均值[21]。

1?2?3菌株的復篩

將初篩產(chǎn)生變色圈的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)5.d，待平板長滿孢子，在無菌操作臺中用打孔篩打出直徑為1.cm的菌塊，接入到已滅菌的含有100.mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250.mL錐形瓶中，于30℃靜置培養(yǎng)5.d，取樣測定發(fā)酵液中的三種木質(zhì)素降解酶的活力，平行操作3次，然后取平均值。

1?2?4菌懸液的制備

將保藏于4℃的固體斜面取出，用接種環(huán)刮下其斜面培養(yǎng)物，接入無菌水中，制成濃度為1×10?6個/mL（血球計數(shù)法測定）的菌懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1?2?5各種木質(zhì)素酶活力的測定

1?2?5?1粗酶液的制備

發(fā)酵液在?6.000?r/min，4℃下離心10.min，所得的上清液為粗酶液。

1?2?5?2錳過氧化物酶活力測定

向反應體系中加入3?4.mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（濃度為200.mmol/L、pH值為4?5），加入0?1.mL 1?6.mmol/L的MnSO?4?溶液和0?4.mL的粗酶液，最后加入0?1.mL 1?6.mmol/L的H?2?O?2?溶液啟動反應，在37℃下反應3.min，測定240.nm的吸光度值。一個酶活單位（U）：每min氧化1.μmol Mn?2+?成為Mn?3+?的需酶量。每個樣品平行操作3次，然后取平均值[22]。

1?2?5?3木質(zhì)素過氧化物酶活力測定

反應液中含1.mL 15.mmol/L藜蘆醇溶液、1?5.mL酒石酸鈉緩沖液（濃度為250.mmol/L、pH值為3）和0?4.mL粗酶液，最后加入0?1.mL 20.mmol/L H?2?O?2?溶液啟動反應，在30℃下反應2.min，測定310.nm下的吸光度值。一個酶活單位（U）：每min氧化1.μmol藜蘆醇成為藜蘆醛的需酶量。每個樣品平行操作3次，然后取平均值[22]。

1?2?5?4漆酶活力測定

向反應體系中加入2.mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（濃度為200.mmol/L、pH值為5）、0?5.mL 0?5.mmol/L的ABTS溶液和0?5.mL粗酶液。在28℃條件下反應10.min后，測定600.nm下的吸光度值。一個酶活單位（U）：每min使1.μmolABTS轉(zhuǎn)化為ABTS自由基所需的量。每個樣品平行操作3次，然后取平均值[22]。

1?2?6菌絲球直徑的測量

將20個菌絲球在平板上排成一排，用濾紙吸干表面水分，用直尺測總長再取平均值即為一個菌絲球的直徑。

1?2?7干濕比的測定

隨機選取20個菌絲球，用濾紙吸干表面水分，進行稱重，此為濕重;隨后將其放入烘箱中在70℃條件下進行烘干，直至恒重后再進行稱重，此為干重;干重比上濕重，即為干濕比。

1?2?8菌絲球掃描電子顯微鏡觀察

將單一真菌菌絲球取出，用生理鹽水沖洗，放置在培養(yǎng)皿中，分別觀察外觀形態(tài)，用S?3400N型掃描電子顯微鏡觀察其內(nèi)部形態(tài)。

2結(jié)果與討論

2?1菌株的分離純化

2?1?1菌株的分離純化

根據(jù)菌落形態(tài)的特征，從10份污泥樣品中分離純化出56株菌，接種到斜面培養(yǎng)基中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2?1?2菌株的初篩

經(jīng)過初篩實驗，共有5株菌發(fā)生了變色反應，對于木質(zhì)素降解菌來說，變色圈的產(chǎn)生有兩種情況（菌絲圈直徑為?d?1?，變色圈直徑為d?2?）：（1）菌絲圈在變色圈內(nèi)部形成（即d?1?d?2?），?變色系數(shù)=菌絲圈直徑/變色圈直徑。研究表明，變色系數(shù)值可作為該菌種能否選擇性降解木質(zhì)素的判斷依據(jù)，如果變色系數(shù)小于1，則該菌可以選擇性降解木質(zhì)素;若變色系數(shù)大于1，則纖維素首先被降解。本研究在第7.d分別對各菌株的菌絲圈（菌落圈）直徑、變色圈直徑及其比值進行了測定，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，5株菌都能產(chǎn)生變色圈反應，且d?1?/d?2?的比值均小于1，初步判斷它們都能優(yōu)先降解木質(zhì)素。

2?1?3菌株的復篩

取5.mL發(fā)生顏色變化菌株的菌懸液，分別接入到含有100.mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250.mL錐形瓶中，于30℃靜置培養(yǎng)5.d，取樣測定發(fā)酵液中的木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶，平行操作3次，然后取平均值。測定結(jié)果如表2所示。

由表2可知，菌株G?1沒有產(chǎn)錳過氧化物酶的能力，菌株G?25沒有產(chǎn)錳過氧化物酶和漆酶的能力。對于錳過氧化物酶，G?13的產(chǎn)酶量是最大的，為8?27.U/L，對于漆酶，G?37的產(chǎn)酶量最大，為1?57.U/L，對于木質(zhì)素過氧化物酶，G?13的產(chǎn)酶量為最大，為13?55.U/L。綜合考慮，選擇具有相對較高木質(zhì)素降解酶活力的G?13作為后續(xù)研究的實驗菌株。該菌株經(jīng)進一步鑒定為煙曲霉，雖已有報道煙曲霉具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶及可降解木質(zhì)素的能力，但本研究所獲得的煙曲霉分離篩選自造紙廠廢水污泥，不同于以往文獻的菌株來源[23， 24]，這就決定了本研究中的菌株將可能具有自身特殊的生理特性。

2?2菌絲球成球條件優(yōu)化

2?2?1碳源對菌絲球成球的影響

碳源是菌體能量的來源，在微生物的生長過程中有著重要的作用。本研究分別用10.g/L的蔗糖、麥芽糖、淀粉，代替菌絲球成球培養(yǎng)基中的葡萄糖，將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，于160.r/min， 30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表3。

由表3可知，淀粉作為碳源，菌絲球的球徑不均一，表面不光滑，培養(yǎng)基呈渾濁的白色。以麥芽糖作為碳源時，菌絲球的彈性很差。而以蔗糖作為碳源時，菌絲球的直徑和干濕比均為最大，球徑約2?15.mm，干濕比為0?335。綜合考慮，選擇蔗糖為碳源時，最有利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?2碳源濃度對菌絲球成球的影響

研究了不同濃度的蔗糖（3.g/L、5.g/L、8.g/L、10.g/L、15.g/L、18.g/L、20.g/L）對G?13成球的影響，將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表4。

由表4可知，當蔗糖濃度為3.g/L時，菌絲球不成球。當蔗糖濃度為5.g/L、10.g/L、20.g/L時，菌絲球的彈性較差，成球狀態(tài)不理想。當蔗糖濃度為18.g/L時，菌絲球球徑均一，表面光滑，球徑和干濕比均為最大，球徑約為2?3.mm，干濕比為?0?038.4。?因此，當碳源濃度為18.g/L時，最利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?3氮源對菌絲球成球的影響

分別用2.g/L的硫酸銨、酒石酸銨、蛋白胨，代替菌絲球成球培養(yǎng)基中的氯化銨，將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G?13的接種量為5.mL，于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表5。

由表5可知，當?shù)鞍纂俗鳛榈磿r，菌絲球的球徑小，培養(yǎng)基呈渾濁的黃色，且有很多不規(guī)則的菌絲碎片。當酒石酸銨作為氮源時，菌絲球的球徑和干濕比最大，球徑約為2?55.mm，干濕比為?0?040.6。?因此，選擇酒石酸銨為最佳氮源時，最有利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?4氮源濃度對菌絲球成球的影響

研究了不同濃度的酒石酸銨（0?5.g/L、0?8.g/L、1.g/L、1?5.g/L、2.g/L、2?5.g/L、3.g/L）對G?13成球的影響，將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表6。

3不成球

由表6可知，隨著氮源濃度的增大，菌絲球的球徑和干濕比整體趨勢上都在增大。當?shù)礉舛刃∮??5.g/L時，菌絲球表面不光滑;當?shù)礉舛却笥??5.g/L時，則不成球，培養(yǎng)基呈渾濁分層的狀態(tài)。當?shù)礉舛葹??5.g/L時，菌絲球的球徑和干濕比最大，球徑約為2?5.mm，干濕比為?0?043.4。?因此，當?shù)礉舛葹??5.g/L時，最利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?5pH值對菌絲球成球的影響

將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其分別為2、3、4、5、6、7、8和9。于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表7。

由表7可知，培養(yǎng)基的pH值過大或過小，G?13均不能成球，培養(yǎng)基的pH值在4-7的范圍內(nèi)能形成球徑均一的球體。隨著培養(yǎng)基pH值的增大，球徑逐漸減小，當培養(yǎng)基的pH值為5時，所形成的菌絲球大小適中，彈性好，不會出現(xiàn)菌絲球球徑大但內(nèi)部空的情況。綜合考慮，當pH值5時，最利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?6接種量對菌絲球成球的影響

將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量分別為1.mL、3.mL、4.mL、5.mL、8.mL、10.mL 和15.mL。于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表8。

由表8可知，當接種量過低時，培養(yǎng)基提供給單個孢子的營養(yǎng)物質(zhì)就會過盛，導致形成的球體直徑較大，彈性差。當接種量過高時，孢子個數(shù)過多會導致晶核數(shù)量多，形成菌絲球的數(shù)量就會增多，菌絲球之間會形成生長空間的競爭，再加上營養(yǎng)物質(zhì)不充足，形成的菌絲球直徑過小，球徑不均一。菌絲球的球徑隨著接種量的增加而減小，當接種量為5.mL時，菌絲球的干濕比最大，球徑均一，大小適中，彈性最好。因此，當接種量5.mL時，最利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?7溫度對菌絲球成球的影響

將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，培養(yǎng)基pH值為5。于160.r/min，溫度分別為26℃、28℃、30℃、34℃和37℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表9。

由表9可知，隨著溫度的升高，菌絲球的球徑逐漸變大。當溫度為26℃時，菌絲球的球徑小，且球體很硬;當溫度為37℃時，菌絲球的球徑最大，但是球徑不均一，彈性很差，培養(yǎng)基中還有很多菌絲碎片;當溫度為28℃時，形成的菌絲球球徑均一，彈性好。綜合考慮，當培養(yǎng)溫度28℃時，最有利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?8轉(zhuǎn)速對菌絲球成球的影響

將G?13同時接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，培養(yǎng)基pH值為5。于30℃，轉(zhuǎn)速分別為120.r/min、140.r/min、160.r/min和180.r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，在第4.d取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見表10。

由表10可知，隨著轉(zhuǎn)速的增大，菌絲球的球徑減小。當轉(zhuǎn)速過低時，菌絲受到的剪切力小，形成的菌絲球球徑大，球體呈松散狀態(tài)，彈性很差，表面不光滑;當轉(zhuǎn)速過高時，菌絲受到的剪切力很大，會打散菌絲球，使菌絲球球徑不均一，形狀不規(guī)則，培養(yǎng)基中有菌絲碎片。轉(zhuǎn)速為160.r/min時形成的菌絲球球徑均一，各方面的性能都很好。因此當轉(zhuǎn)速為160.r/min時，最利于菌絲球的培養(yǎng)。

2?2?9培養(yǎng)時間對菌絲球成球的影響

將G?13接入到100.mL（250.mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5.mL，培養(yǎng)基pH值為5。于160.r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)。每12.h取樣測定菌絲球的直徑和干濕比，結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌絲球的球徑呈增大的趨勢，0-24.h內(nèi)沒有形成菌絲球，24.h之后，菌絲球的直徑逐漸增大，當培養(yǎng)至72.h時，菌絲球的直徑最大，平均球徑約為3?4.mm，此后菌絲球的直徑基本不變。如圖2所示，干濕比隨著培養(yǎng)時間的延長是先增大后減小的趨勢，在72.h時，干濕比最大，為?0?048.1，?隨后干濕比逐漸減小，可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)的消耗導致菌絲球停止生長，內(nèi)部菌絲結(jié)構(gòu)慢慢變得松散，導致干濕比降低。由圖3可見，在最佳成球條件下形成的單一真菌菌絲球大小均勻，表面光滑。將菌絲球切開，利用掃描電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如圖4），可見此時菌絲球生長狀態(tài)好，內(nèi)部呈現(xiàn)中空的結(jié)構(gòu)。從圖5和圖6可見菌絲之間纏繞十分緊實，表面光滑，適合作生物固定化載體。

3結(jié)論

1）從10份樣品中共分離出56株菌，通過初篩實驗獲得5株具有木質(zhì)素降解能力的真菌，經(jīng)過復篩測定這5株菌的木質(zhì)素降解酶的酶活，獲得一株產(chǎn)木質(zhì)素酶活力較高的菌株G?13。

2）碳源，氮源，pH值，溫度，轉(zhuǎn)速等因素對菌絲球成球有較大影響。在最佳成球條件下培養(yǎng)所獲得的菌絲球球徑適中，表面光滑，彈性好，易于固液分離，是一種很好的生物質(zhì)載體。

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