孫靜，陸賽衛(wèi)，高英杰，趙榮華，郭姍姍，時宇靜，曲天歌，玄振玉*，崔曉蘭*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215001； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

急性細(xì)菌性咽炎是由細(xì)菌感染引起的咽部黏膜、黏膜下組織及其淋巴組織的急性炎癥，是耳鼻喉科常見病、多發(fā)病，主要表現(xiàn)為咽喉紅腫疼痛等癥狀[1]。西醫(yī)多采用抗生素類藥物治療急性細(xì)菌性咽炎，但藥物毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性[2]。中藥治療急性細(xì)菌性咽炎具有毒副作用小、藥效持久，辨證論治，標(biāo)本兼治等特點。咽喉寧口服液功能主治為清熱解毒，清利咽喉，臨床用于急性咽炎的治療。本研究采用乙型溶血性鏈球菌感染致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型及體內(nèi)外抗菌、鎮(zhèn)痛、止癢模型，評價咽喉寧口服液治療急性細(xì)菌性咽炎的藥效。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑

咽喉寧口服液干膏粉(批號：141101)，由蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司提供；咽炎片(批號：1312030Z)，華潤三九(黃石)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；阿莫西林膠囊(批號：A1406029)，哈藥集團制藥總廠產(chǎn)品；阿司匹林腸溶片(批號：BJ09503)，拜耳公司產(chǎn)品；醋酸潑尼松片(批號：1409157)，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品；組織胺磷酸(批號：51-74-1)，杭州大陽化工有限公司。

1.2 實驗動物

ICR小鼠(SPF/VAF級)，體質(zhì)量13～15 g，18～20 g，SD大鼠(SPF/VAF級)，體質(zhì)量140～160 g，雌雄各半，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證：SCXK(京)2012-0001；豚鼠，體質(zhì)量250～350 g，雌雄各半，普通級，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動物許可證：SCXK(京)2015-0005。

1.3 實驗儀器

電子天平(YP1002)，上海越平科學(xué)儀器有限公司；電子天平(BSA3202S-CW)，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；恒溫水浴箱(DK-660B)，上海森信實驗儀器有限公司；咽喉噴霧器，貴州宏宇藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

2 實驗方法及結(jié)果

2.1 對乙型溶血性鏈球菌致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型的影響

取SD大鼠60只，體質(zhì)量140～160 g，雌雄各半，隨機分為6組，分別為正常對照組、模型對照組、咽炎片對照組、咽喉寧口服液干膏粉1.16 g/(kg·d)、0.58 g/(kg·d)、0.29 g/(kg·d)3個劑量組，每組10只。除正常對照組外，使用滅菌鑷子翻開大鼠口腔，暴露上頜黏膜，用注射器將吸有1×109cfu/mL濃度乙型溶血性鏈球菌菌液水平方向點刺鼻咽部黏膜，并注射菌液，操作程度以略有點狀出血為度，每只0.1 mL，連續(xù)感染2 d。第1天感染后1 h各動物按10 mL/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，正常對照組和模型對照組在同等條件下給蒸餾水。第4天觀察大鼠咽部黏膜病變程度，進(jìn)行咽部體征評分。咽部體征評分標(biāo)準(zhǔn)：4分：軟腭、軟腭弓、咽后壁均出現(xiàn)紅色瘀血點，可見覆有白色膿點；3分：軟腭、軟腭弓、咽后壁出現(xiàn)紅色瘀血點；2分：軟腭、軟腭弓或咽后壁有充血紅腫；1分：軟腭有紅腫；0分：上顎無紅腫表現(xiàn)[3]。

2.2 體外抗菌作用

試驗前將咽喉寧口服液及咽炎片用蒸餾水配制成50 mg/mL的原藥液；阿莫西林膠囊配制成濃度為5 mg/mL的原藥液，過濾除菌備用。菌液制備：試驗前取保存的各菌液，每種20 μL加入到肉湯培養(yǎng)基2 mL中，置入振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。試驗時將培養(yǎng)好的菌液用肉湯培養(yǎng)基逐步稀釋成3×105個菌/mL濃度。試驗時用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將各原藥液做1:2～1:64倍倍比稀釋后，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔150 μL，再加入3×105個菌/mL的各種菌液10 μL，每個濃度做2個復(fù)孔同時設(shè)細(xì)菌對照組和正常對照組。置振蕩培養(yǎng)箱，36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各孔中細(xì)菌生長情況，確定無細(xì)菌生長的最低藥物濃度(MIC)。

2.3 對金黃色葡萄球菌感染致小鼠死亡的保護(hù)作用

取ICR小鼠120只，體質(zhì)量13～15 g，雌雄各半，按體質(zhì)量等級隨機分為6組，分別為模型對照組、阿莫西林對照組、咽炎片對照組，咽喉寧口服液高、中、低3個劑量組，每組20只。各給藥組灌胃給藥，0.02 mL/g，每日1次，連續(xù)5 d，感染對照組在同等情況下給蒸餾水。第3天給藥1 h后各組動物腹腔注射9×108cfu/mL金黃色葡萄球菌菌液，0.2 mL/只。感染后每日觀察動物的死亡情況，連續(xù)7 d，記錄死亡數(shù)，計算死亡率、保護(hù)率、平均存活天數(shù)及生命延長率。

2.4 對熱板致小鼠疼痛模型的影響

調(diào)節(jié)恒溫水?。合葘⑺〔奂訚M水，使水面接觸熱板，調(diào)節(jié)恒溫裝置，使水溫控制在(55.0±0.5)℃，熱板需預(yù)熱10 min。

篩選合格小鼠：取ICR小鼠，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，每次1只放在熱板上，小鼠自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間(s)，作為該鼠的痛閾值，凡舔后足時間小于5 s或大于30 s或跳躍者棄之不用。

觀察藥物作用：取合格小鼠60只，按體質(zhì)量等級分為模型對照組、阿司匹林對照組、咽炎片對照組，咽喉寧口服液高、中、低3個劑量組，每組10只。各組小鼠重復(fù)測其正常痛閾值2次，取2次平均值，作為該鼠給藥前痛閾值。各給藥組小鼠灌胃給藥，0.02 mL/g，模型對照組在同等情況下給蒸餾水。給藥后1 h、2 h、3 h分別測小鼠痛閾值，如60 s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計算。

根據(jù)痛閾值計算鎮(zhèn)痛率，以鎮(zhèn)痛率來比較各組的鎮(zhèn)痛效果。

鎮(zhèn)痛率%=(用藥后痛閾值-用藥前平均痛閾值)×100%/用藥前平均痛閾值

2.5 對組胺致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

取豚鼠70只，體質(zhì)量250～350 g，雌性各半，隨機分為7組，分別為正常對照組，模型對照組，咽炎片對照組，醋酸潑尼松對照組、咽喉寧口服液高、中、低劑量組。各給藥組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3 d，正常對照組及模型對照組在同等情況下灌胃蒸餾水。第3天給藥2 h后將各組豚鼠右后足背脫毛，用砂紙擦傷豚鼠右后足背脫毛處，面積約1 cm2，除正常對照組外其余動物在創(chuàng)面處滴0.1%組胺磷酸液0.05 mL/足，以后每隔3 min將組胺磷酸液滴在創(chuàng)面上，直至豚鼠回頭舔右后足為止，以此時所給的組胺磷酸總量為致癢閾。若滴加10次，豚鼠仍沒回頭舔后足，則以10次所給的組胺磷酸量為致癢閾。正常對照組同等情況下滴蒸餾水。

2.6 統(tǒng)計方法

結(jié)果采用組間比較t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

3 實驗結(jié)果

3.1 對乙型溶血性鏈球菌致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型的影響

表1結(jié)果顯示：肉眼觀察模型組大鼠咽部出現(xiàn)紅色瘀血點并附有白色膿點，咽部體征評分顯著增高，與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.01)；咽喉寧口服液3個劑量組大鼠咽部病變均明顯減輕，咽部體征評分下降，與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。

注：與正常對照組比較，##P<0.01,#P<0.05；與模型對照組比較，**P<0.01,*P<0.05

3.2 體外抗菌作用

表2結(jié)果顯示：經(jīng)24 h培養(yǎng)后，細(xì)菌對照組均有菌株生長。咽喉寧口服液對所試的6株菌株均有不同程度的抑制作用，MIC在6.25～25 mg/mL之間。

3.3 對金黃色葡萄球菌感染致小鼠死亡的保護(hù)作用

表3結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個劑量組均可降低金黃色葡萄球菌感染所致小鼠死亡數(shù)，其中中劑量組死亡保護(hù)率為38.89%，并延長平均存活天數(shù)，中、小劑量組生命延長率分別為139.39%和103.03%，與模型對照組比較有顯著性差異，(P<0.05，P<0.01)。

3.4 對熱板致小鼠疼痛模型的影響

表4結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個劑量組給藥后1 h、2 h、3 h均可提高熱板致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛率，其中高、中劑量組給藥后3 h與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。

表2 咽喉寧口服液體外抑菌試驗

注：“-”表示無細(xì)菌生長，“ +”表示有細(xì)菌生長

表3 咽喉寧口服液對金黃色葡萄球菌致小鼠死亡的保護(hù)作用

注：與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

表4 咽喉寧口服液對熱板所致小鼠疼痛模型的影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 對組胺致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

表5結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個劑量組均可提高組胺致豚鼠的致癢閾，與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。

表5 咽喉寧口服液對組胺所致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

急性細(xì)菌性咽炎是細(xì)菌感染引起的咽部黏膜，并波及黏膜下及淋巴組織的急性炎癥，常繼發(fā)于急性鼻炎或急性扁桃體炎之后或為上呼吸道感染之一部分[4-5]。亦常為全身疾病的局部表現(xiàn)或為急性傳染病之前驅(qū)癥狀。常因受涼，過度疲勞，煙酒過度等致全身及局部抵抗力下降，病原菌乘虛而入而引發(fā)本病。引起急性細(xì)菌性咽炎的致病菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌等，其中乙型溶血性鏈球菌是臨床最易引起兒童及成人上呼吸道感染，從而引發(fā)咽喉炎、扁桃體炎的致病力較強的病原菌[6-8]。當(dāng)前，臨床治療急性細(xì)菌性咽炎的藥物仍以抗生素為主，但抗生素耐藥及毒副作用問題日益嚴(yán)重，因此，醫(yī)學(xué)界越來越偏重于發(fā)展中醫(yī)藥治療。中藥復(fù)方因化學(xué)成分復(fù)雜、治療面廣，對于恢復(fù)人體微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防感染、干預(yù)抗藥性形成都具有較好的作用[9-10]。

咽喉寧口服液由山豆根、龍葵、射干、黃芪、甘草組成，具有清熱解毒，清利咽喉的功效，臨床治療各種急、慢性咽炎，療效顯著。方中山豆根性寒、味苦；有清熱解毒，消腫利咽之功效，為君藥；龍葵性寒、味苦，有清熱解毒，活血消腫之功效；射干性寒、味苦，有清熱解毒、散結(jié)消炎、消腫止痛、止咳化痰之功效，與龍葵共為臣藥；黃芪性溫、味甘，有補氣固表、利水退腫之功效，能減緩山豆根、射干的苦寒之性，為佐藥。甘草為使藥，具有補脾益氣，袪痰止咳，調(diào)和諸藥之功效。本研究結(jié)果表明咽喉寧口服液3個劑量組對乙型溶血性鏈球菌感染引起的大鼠急性咽炎均具顯著的療效，給藥組大鼠咽部體征評分與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。體內(nèi)外抗菌試驗、熱板實驗和組胺致豚鼠皮膚瘙癢實驗結(jié)果顯示咽喉寧口服液3個劑量組均具有不同程度的體內(nèi)外抗菌、鎮(zhèn)痛、止癢作用。