薛丕良,張玉昆，袁茵，白茹，劉欣欣，鄧思瑤， 黃雅晨，肖洪彬，牛雯穎*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150042；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)又稱膜性腎小球腎炎(membranous glomerulonephritis,MG)，是腎病綜合征常見(jiàn)的病理類型之一。該病理類型的特點(diǎn)是腎小球上皮細(xì)胞下彌漫的免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫增厚。在臨床上約70%～80%的膜性腎病患者以腎病綜合征為表現(xiàn)形式，大多數(shù)病人腎功能正?；蛏贁?shù)輕度受損，臨床上該病動(dòng)靜脈血栓發(fā)生率較高，尤其以腎靜脈血栓最為常見(jiàn)。目前膜性腎病發(fā)病呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的健康，臨床上使用參芪蛭龍湯取得較好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察參芪蛭龍湯對(duì)陽(yáng)離子牛血清白蛋白致大鼠膜性腎病的藥效學(xué)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(228±19)g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(黑)2008004。

1.2 受試藥物

參芪蛭龍湯中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。

1.3 儀器

C2000-A全自動(dòng)血凝儀(北京普利生儀器有限公司)，LBY-N7500B全自動(dòng)血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)，XS-500i全自動(dòng)血液分析儀(希森美康醫(yī)用電子上海有限公司)，魅力2000型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)百昂集團(tuán)儀器公司)。

1.4 試劑

纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為1804041、1807016、1805062、1801008)；白蛋白(Alb) 、總蛋白(TP)、肌酐(CRE)、尿素氮(VREA)、葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT/GPT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST/GOT)測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為171419、171341、183531、183537、183642、182011、167651、170641、170541、182661、171351)。

2 方法

2.1 制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)

參照Border法[1-2]，取67 mL無(wú)水乙二胺(EDA)液，加入500 mL雙蒸水，再加入6 mol/L鹽酸350 mL，調(diào)整pH值到4.75，冷卻至25℃，進(jìn)行攪拌，再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5 g溶于25 mL重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加1.8 g炭化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCL)維持25℃，持續(xù)攪拌2 h，保持pH值4.75，最后加4 mol/L(pH值4.75)的醋酸緩沖液30 mL，終止反應(yīng)，即得到等電點(diǎn)提高的C-BSA溶液。將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72 h(3～5 h換水1次)，冷凍干燥后，即得BSA干粉。用聚丙烯酰胺等測(cè)定其等電點(diǎn)(PI)，PI>8.5即可。C-BSA保存于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型制作

取Wistar大鼠40只，在實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室(環(huán)境溫度26℃，相對(duì)濕度60%)適應(yīng)環(huán)境，一周后，將大鼠分別置代謝籠中，接24 h尿測(cè)尿蛋白；眼眶靜脈采血，分離血清，測(cè)白蛋白、血清總膽固醇、甘油三酯、肌酐和尿素氮。

預(yù)免疫：對(duì)尿蛋白陰性的大鼠，留出10只作空白對(duì)照，對(duì)其余大鼠進(jìn)行預(yù)免疫。將80 mg C-BSA溶于15 mL PBS中，與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲乳化完全后進(jìn)行預(yù)免疫。除空白對(duì)照組外，于每只大鼠腹股溝、腋窩等處進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，每只0.3 mL的乳化物，每點(diǎn)注射不超過(guò)0.05 mL。正常對(duì)照組則以PBS與弗氏不完全佐劑按上述比例乳化后進(jìn)行皮下注射。一周后，進(jìn)行正式免疫(制作模型)：每次將C-BSA溶于1 mLPBS中進(jìn)行尾靜脈注射，首次C-BSA尾靜脈注射量為3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周內(nèi)緩慢將注射量遞增至5 mg/只，正常對(duì)照組注射同體積的PBS。6周后留取動(dòng)物24 h尿，測(cè)血清白蛋白、血清總膽固醇、甘油三酯確定動(dòng)物模型成功[1-2]。

2.3 中藥制備

參芪蛭龍湯處方組成：黨參20 g，黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，水蛭5 g(研末沖服)，地龍20 g，白僵蠶15 g，虎杖15 g，淫羊藿30 g，鳳尾草15 g。制法：以上10味，加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，濾過(guò)，再加10倍量水煎煮1 h，濾過(guò)，濾液合并，濃縮成1∶1 4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 分組和給藥

尿蛋白陰性未進(jìn)行模型制作的10只大鼠分為空白組，其余制作膜性腎病模型大鼠30只，隨機(jī)分為3組，即模型組、中藥低劑量組和中藥高劑量組?？瞻捉M：給予與參芪蛭龍湯組同等量的生理鹽水；模型組：給予與參芪蛭龍湯組同等量的生理鹽水；中藥低劑量組：根據(jù)人(70 kg)的給藥量換算成大鼠給藥劑量約為4 g生藥/kg，灌胃；中藥高劑量組：根據(jù)人(70 kg)換算成大鼠給藥劑量約為8 g生藥/kg，灌胃。在造模2周后開(kāi)始給予中藥湯劑早晚各1次，連續(xù)給藥4周。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

各組大鼠于治療4周結(jié)束時(shí)先留取24 h尿，之后用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血。

2.5.1 檢查生化指標(biāo)

取枸櫞酸鈉抗凝血離心(3 000 r·min-1，10 min)取血漿，全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AlT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)測(cè)定。

2.5.2 檢查血常規(guī)

取EDTA-K2抗凝血對(duì)白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)計(jì)數(shù)測(cè)定。

2.5.3 全血黏度和血漿黏度的測(cè)定

取肝素抗凝血1 mL離心(3 000 r·min-1，10 min)，取血漿用于全血黏度和血漿黏度測(cè)定。

2.5.4 凝血4項(xiàng)的測(cè)定

取枸櫞酸鈉抗凝血的血漿按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。FIB、PT、TT和APTT。

2.5.5 24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)測(cè)定

留取大鼠24 h尿液，采用雙縮脲法測(cè)定24-UTP。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 生化指標(biāo)的測(cè)定

3.1.1 肝功指標(biāo)

與空白組比較，模型組TP、ALB含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組TP、ALB含量呈上升趨勢(shì)(P>0.05)；中藥高劑量組TP、ALB含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，3組AST、ALT均無(wú)顯著變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 中藥高低劑量組對(duì)大鼠肝功的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

3.1.2 血脂含量的測(cè)定

與空白組比較，模型組TC、HDL-C含量顯著上升(P<0.05)，TG含量顯著上升(P<0.01)。與模型組比較，中藥高低劑量組TC含量均顯著下降(P<0.05)；中藥低劑量組TG含量呈下降趨勢(shì)(P>0.05)，中藥高劑量組TG含量顯著下降(P<0.05)；中藥高低劑量組HDL-C含量無(wú)明顯變化(P>0.05)；3組LDL-C含量均無(wú)顯著變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中藥高低劑量組對(duì)大鼠血脂含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3.1.3 血糖、尿素氮和肌酐的測(cè)定

與空白組比較，模型組GLU含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組GLU含量升高(P>0.05)，中藥高劑量組GLU含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，3組BUN、Scr含量均無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中藥高低劑量組對(duì)大鼠GLU、BUN、Scr含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

3.2 血常規(guī)測(cè)定

與空白組比較，模型組RBC計(jì)數(shù)下降明顯(P<0.01)；PTL計(jì)數(shù)升高明顯(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組RBC計(jì)數(shù)上升(P>0.05)；中藥高劑量組明顯升高(P<0.05)；中藥高低劑量組PTL計(jì)數(shù)明顯下降(P<0.05)；3組WBC含量均無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3 凝血四項(xiàng)的測(cè)定

與空白組比較，模型組FIB含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組FIB含量下降(P>0.05)；中藥高劑量組FIB含量明顯下降(P<0.01)；3組TT、APTT、PT含量均無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 中藥高低劑量組對(duì)大鼠WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

表5 中藥高低劑量組對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

3.4 全血黏度和血漿黏度的測(cè)定

與空白組比較，全血黏度高切200 s-1模型組全血黏度明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥高低劑量組全血黏度呈上升趨勢(shì)(P>0.05)；3組血漿黏度和全血黏度低切3 s-1、中切60 s-1無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 中藥高低劑量組對(duì)全血黏度和血漿黏度的影響

注：與空白組比較,△△P<0.01

3.5 尿蛋白定量測(cè)定

與空白組比較，模型組尿蛋白定量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥低劑量組尿蛋白定量呈下降趨勢(shì)(P>0.05)；中藥高劑量組尿蛋白定量明顯下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 中藥高低劑量組對(duì)大鼠尿蛋白定量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05;與空白組比較,△△P<0.01

4 討論

近年來(lái)，膜性腎病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。當(dāng)前該病的西醫(yī)治療手段主要是糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等。2012年KDIGO指南提出，不推薦單獨(dú)使用糖皮質(zhì)激素作為治療原發(fā)性膜性腎病(IMN)的首選治療方案[3]，推薦激素聯(lián)合免疫抑制劑有一定的臨床價(jià)值。目前糖皮質(zhì)激素常常聯(lián)合的免疫抑制劑為烷化劑、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、嗎替麥考酚酯和來(lái)氟米特等。常用的烷化劑為環(huán)磷酰胺和苯丁酸氮芥，研究表明環(huán)磷酰胺更有效且毒性更小。環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，主要是通過(guò)降低T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，尤其對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用更為明顯。臨床研究顯示：口服潑尼松第1個(gè)月1 mg/(kg·d)、在第2、3個(gè)月左右逐漸開(kāi)始減量；同時(shí)每月使用環(huán)磷酰胺沖擊，沖擊方案為0.6 g/d,連用2 d,靜脈滴注，該方案治療IMN，不良反應(yīng)較小，安全性相對(duì)較高[4]。臨床上烷化劑治療IMN取得不錯(cuò)的療效，但是由于其短期和長(zhǎng)期的毒副作用限制了該藥在臨床上的廣泛使用[5]，尤其是長(zhǎng)期使用所引起的不可逆的性腺毒性和癌癥[6]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(CNI)主要通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶，從而阻止T淋巴細(xì)胞核因子的信號(hào)激活，抑制T淋巴細(xì)胞活化，此類的代表性藥物有環(huán)孢素A(CSA)和他克莫司(FK506)。文獻(xiàn)研究報(bào)道，IMN患者使用小劑量的環(huán)孢素A 6個(gè)月以上，能夠有效地控制病情，達(dá)到完全緩解，且不容易復(fù)發(fā)[7]。最近幾年，F(xiàn)K506廣泛應(yīng)用于腎臟病領(lǐng)域，尤其在膜性腎病的治療中取得較好的療效，具有起效快、副作用少的優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究也進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)K506與環(huán)磷酰胺和驍悉相比，能更快緩解膜性腎病患者蛋白尿，同時(shí)升高血漿白蛋白，因此臨床上FK506可作為膜性腎病的首選藥物。國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，F(xiàn)K506與環(huán)磷酰胺在治療IMN上，臨床緩解率分別為85%和65%[8]。文獻(xiàn)報(bào)道CNI治療IMN患者，復(fù)發(fā)率較高，即使療程延長(zhǎng)至18或24月后停藥，復(fù)發(fā)率仍然在50%左右，提示延長(zhǎng)用藥時(shí)間或許并不能減少該類藥物停藥后的復(fù)發(fā)率。如果患者病情復(fù)發(fā)重新使用初始的治療方案也有效[2]。目前膜性腎病常用的治療方案是小劑量激素聯(lián)合FK506，但是停藥后復(fù)發(fā)率比較高。

綜上所述，雖然西醫(yī)對(duì)該病治療有一定的療效，但也有明顯的副作用，停藥后容易復(fù)發(fā)。中藥對(duì)該病的治療取得較好的療效，沒(méi)有明顯的毒副作用，參芪蛭龍湯是在廣泛查閱文獻(xiàn)，總結(jié)歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，反復(fù)遴選，精簡(jiǎn)藥味，并應(yīng)用臨床多年的經(jīng)驗(yàn)方，療效確切。膜性腎病基本病機(jī)以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標(biāo)，方中黨參、黃芪補(bǔ)益脾氣，淫羊藿補(bǔ)益腎陽(yáng)，鼓舞腎氣，為君藥；當(dāng)歸、川芎活血化瘀，水蛭、地龍、白僵蠶蟲(chóng)類入絡(luò)，化瘀消癥為臣藥；虎杖、鳳尾草活血化瘀，利水消腫為佐藥；全方共湊補(bǔ)益脾腎，化瘀利濕之效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)[9]黃芪具有降低蛋白尿、提高血漿白蛋白、調(diào)節(jié)脂代謝、改善高凝狀態(tài)、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。水蛭具有抑制血小板活化、抗血栓、改善血液粘稠度、降低血脂等藥理作用[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，川芎嗪能夠減少膜性腎病大鼠腎小球免疫復(fù)合物的沉積，抑制基底膜增厚，降低血肌酐及尿素氮水平[11-12]。地龍類藥物能使陽(yáng)離子牛血清白蛋白誘導(dǎo)的腎炎大鼠尿蛋白減少，血漿白蛋白升高，腎臟病理?yè)p害減輕[13]。當(dāng)歸可以降低血小板聚集、降低血脂、改善腎組織的血液灌注，減輕腎臟組織的缺氧性損傷[14-15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,參芪蛭龍湯明顯降低尿蛋白、升高血清總蛋白和白蛋白的作用；參芪蛭龍湯改善膜性腎病大鼠高脂高凝狀態(tài)，升高血糖，無(wú)明顯肝腎毒副作用。