張 靜， 周永剛， 舒俊斌， 李曉波， 呂曉俊， 葉汝勇， 李正在

(1永康市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 浙江 金華 321300； 2浙江省腫瘤醫(yī)院腦外科， 浙江 杭州 310022)

目前國內(nèi)外公認的膠質(zhì)瘤有效的治療方案是根治性手術(shù)治療配合術(shù)后放化療，但即便接受正規(guī)的內(nèi)外科聯(lián)合治療，其中位生存期也不超過12個月[1-2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)作為第2代烷化劑，可通過誘導鳥嘌呤殘基的甲基化從而誘導細胞凋亡，TMZ結(jié)合放療治療膠質(zhì)瘤較單獨放療可明顯改善膠質(zhì)瘤患者預后，目前已成為膠質(zhì)瘤治療中的標準化療藥物。但僅有不超過一半膠質(zhì)瘤患者對TMZ敏感，機體先天及獲得性耐藥是制約患者對TMZ化療效果的關(guān)鍵原因。因此，尋找能有效抑制膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥的治療手段一直是當前神經(jīng)外科領域的重要研究領域[3-4]。

微小RNA(microRMA，miRNAs，miR)作為一組內(nèi)生的非編碼序列，可通過與目的基因3’-UTRs的不完全配對從而誘導目的基因mRNA降解。當前研究發(fā)現(xiàn),miRNAs所調(diào)控的靶基因在包括細胞增長、分化及轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種病理生理過程中扮演著重要的角色[5]。近來研究表明,miRNAs在腫瘤細胞對化療藥物耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，例如miR-873可通過靶向調(diào)控Bcl-2從而改善膠質(zhì)瘤對順鉑的耐藥性[6]，而miR-16可通過調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞凋亡從而改善膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的耐藥性[7]，繼而表明miRNAs可作為一種有效改善膠質(zhì)瘤耐藥性的調(diào)節(jié)劑從而用于膠質(zhì)瘤臨床治療。目前miR-130b在膠質(zhì)瘤細胞中的表達以及與膠質(zhì)瘤耐藥性是否存在一定相關(guān)性尚未可知。本次研究將探討miR-130b與膠質(zhì)瘤對TMZ獲得性耐藥的關(guān)系及其可能的作用機制，為膠質(zhì)瘤的防治研究提供有益的實驗參考，造福于膠質(zhì)瘤患者健康。

材 料 和 方 法

1 細胞和試劑

膠質(zhì)瘤細胞株U251、SHG-44和U87購自上海細胞生物研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青公司；含EDTA胰蛋白酶購自中國吉諾公司；TMZ購自Schering-Plough；Bay 11-7082購自Sigma；LipofectamineTM2000購自Life Technologies；miR-130b及內(nèi)參照U6的引物和探針由廣州銳博生物公司設計合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自ABI；miR-130b mimics和miR-130b inhibitor及其陰性對照mimics NC和inhibitor NC均購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；DMSO、CCK-8試劑盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液購自北京中山生物工程公司；螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)試劑盒購自Pierce；抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和Bcl-2抗體購自Epitomics；抗X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)、survivin和β-actin抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) U251、SHG-44和U87細胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清，細胞均置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中，當細胞貼壁鋪滿80%～90%視野時，使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

2.2不同濃度TMZ的配制 TMZ在pH<5時保持穩(wěn)定，而當pH>7時易分解。TMZ為脂溶性，使用DMSO將TMZ溶解。將100 mg原藥TMZ加入10 mL的DMSO中，待其完全溶解后再經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后，配制成1 g/L的母液，避光保存于4 ℃冰箱內(nèi)，臨使用時將母液置于37 ℃水浴箱內(nèi)溶解后再添加DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，控制DMSO終濃度保持在0.1%以下，該濃度對細胞生長無明顯影響。使TMZ梯度濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L和100 μmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3CCK-8法檢測膠質(zhì)瘤細胞活力及測定IC50值 將對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤細胞制備成單細胞懸液后接種于96孔板中，每孔2×104個細胞，并調(diào)整每孔接種細胞懸液量為100 μL，每組細胞設立5個復孔，加入含TMZ的DMEM完全培養(yǎng)基液(0～1 000 μmol/L)，將細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于細胞孵育48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，再次將培養(yǎng)板放置在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，最后在酶標儀的490 nm波長處測定吸光度(A)值。橫坐標為不同濃度TMZ，縱坐標為細胞生長抑制率，繪制不同劑量-細胞生長抑制率曲線圖，通過SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件的Probit過程計算出IC50。

2.4建立對TMZ耐藥的膠質(zhì)瘤細胞株 取對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤U251細胞，通過梯度遞增培養(yǎng)基中TMZ濃度，結(jié)合參考文獻中得出較為合理的TMZ耐藥性誘導濃度梯度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L和100 μmol/L，誘導期間每隔3 d 更換TMZ培養(yǎng)液1次。首先添加濃度為1 μmol/L的TMZ培養(yǎng)基，待細胞生長穩(wěn)定2周后開始增加TMZ藥物濃度，每個濃度維持10 d 左右，6個月后即可誘導出對濃度為20 μmol/L的TMZ耐藥的細胞株，將其命名為U251/TR細胞株，為了維持U251/TR細胞的耐藥性保持穩(wěn)定，培養(yǎng)耐藥細胞的培養(yǎng)基為含20 μmol/L TMZ的完全培養(yǎng)基。U251/TR細胞株的耐藥指數(shù)(resistance factor, RF)=IC50(U251/TR)/IC50(U251)。

2.5細胞轉(zhuǎn)染及分組 收集對數(shù)生長期膠質(zhì)瘤細胞，用完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液并調(diào)整濃度為5×109/L，將細胞懸液接種至6孔板中，每孔100 μL，每組設3個復孔，待細胞融合至70%～80%時進行細胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進行操作，實驗分為4組：mimics NC組,每孔U251/TR細胞加入100 nmol的mimics NC及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-130b mimics組,每孔U251/TR細胞加入100 nmol的miR-130b mimics及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；inhibitor NC組,每孔U251細胞加入100 nmol的inhibitor NC及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-130b inhibitor組,每孔U251細胞加入100 nmol的miR-130b inhibitor及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞行RT-qPCR檢測，確定轉(zhuǎn)染效率后再進行細胞體外實驗。

2.6RT-qPCR檢測miR-130b 的表達 在轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細胞中用TRIzol試劑提取細胞總RNA，RNA濃度由超微量分光光度計檢測，逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，設置U6作為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法計算miR-130b的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

2.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集處于對數(shù)生長期的U251/TR和U251細胞，經(jīng)冰PBS緩沖液洗滌3次，調(diào)整細胞濃度為1×106～1×107/L，加入50 μL Binding Buffer和2.5 μL Annexin V試劑(20 mg/L)在室溫下避光反應30 min，再添加5 μL PI和100 μL Binding Buffer在室溫下避光反應5 min，立即使用流式細胞儀進行定量檢測，實驗重復3次，取平均值。

2.8螢光素酶報告基因檢測 將重組螢光素酶報告載體Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和WT-psiCHECK-TNF-α-3’UTR共轉(zhuǎn)染入U251細胞中，再分別將miRNA-130b inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染至U251細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞，按螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書提供的方法對樣品螢光素酶活性進行檢測，每組樣本設5個復孔。螢光素酶相對活性=螢火蟲螢光素酶發(fā)光強度/海腎螢光素酶發(fā)光強度。

2.9EMSA檢測NF-κB活性 按照EMSA試劑盒的說明書進行檢測，使用細胞裂解液處理細胞后，再使用BSA法對各組細胞蛋白含量進行測定。采用雙鏈寡核酸NF-κB序列探針(sense: 5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’; antisense: 5’-GCCTGGGAAA-GTCCCCTCAACCTGA-3’)，6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠100 V預電泳60 min，待溴酚藍泳動為3/4全長時停止電泳，再將帶正電的尼龍膜和膠同時夾入電泳轉(zhuǎn)移槽進行印跡轉(zhuǎn)移，反應條件為380 mA轉(zhuǎn)移30 min。將膜置于濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移至紫外燈下交聯(lián)15 min，在封閉液和平衡液中于室溫下分別反應20 min，經(jīng)化學發(fā)光和X線曝光后拍照。用Quantity One 4.6.2軟件(Bio-Rad)對圖形進行灰度掃描，灰度值越高表示NF-κB激活程度越高。

2.10Western blot法檢測蛋白表達 膠質(zhì)瘤細胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取總蛋白，每份樣品使用20 μg蛋白質(zhì)，使用10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4 ℃下使用5%脫脂奶粉封閉過夜，硝酸纖維素膜經(jīng) I 抗和 II 抗反應后滴加新鮮配制的ECL化學發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。所有本次實驗所得的計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q法分析總體及總體中兩樣本均數(shù)之間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度TMZ對不同膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用

CCK-8法檢測細胞活力結(jié)果表明，TMZ對體外U251、SHG-44和U87細胞均有不同程度的生長抑制作用，隨著TMZ濃度的增加，其生長抑制作用更強,見表1。通過Probit過程計算得出，TMZ對不同膠質(zhì)瘤細胞株(U251、SHG-44和U87)的IC50分別為54.8、94.8和149.6 μmol/L，選擇TMZ的IC50相對較低的U251細胞作為后續(xù)實驗。

2 體外耐TMZ膠質(zhì)瘤細胞株(U251/TR)的建立

歷時6個月，經(jīng)過8個濃度梯度誘導，成功培養(yǎng)對TMZ耐藥的U251/TR細胞株，利用CCK-8法檢測TMZ對U251/TR細胞的生長抑制作用，檢測結(jié)果如表1。TMZ對U251/TR細胞的IC50為465.4 μmol/L，RF為8.1。

表1CCK-8法檢測不同濃度TMZ對不同膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用

Table 1.The viability of glioma cell lines was analyzed by CCK-8 assay after incubated with TMZ at increasing concentrations (Avalue. Mean±SD.n=5)

TMZ (μmol/L)U251 cellsSHG-44 cellsU87 cellsU251/TR cells01.485±0.3571.652±0.3431.581±0.4160.927±0.19651.047±0.2861.428±0.2411.286±0.3610.907±0.246500.915±0.2471.206±0.2491.207±0.2490.867±0.2181000.804±0.2480.987±0.2681.176±0.3130.843±0.1692500.517±0.1380.876±0.1960.954±0.2320.784±0.1585000.377±0.0860.547±0.1130.685±0.1270.724±0.1281 0000.261±0.0370.449±0.1240.559±0.1470.531±0.104

3 轉(zhuǎn)染miR-130b mimics和miR-130b inhibitor對膠質(zhì)瘤細胞中miR-130b表達的影響

首先運用RT-qPCR方法檢測miR-130b在體外U251細胞和U251/TR細胞中的表達，結(jié)果表明miR-130b在U251細胞中的表達較在U251/TR細胞中明顯上調(diào)，兩者相差7.51倍(P<0.01)，見圖1A。

將miR-130b mimics轉(zhuǎn)染至U251/TR細胞，同時將miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染至U251細胞48 h后，利用RT-qPCR檢測細胞中miR-130b的表達，結(jié)果表明miR-130b mimics組U251/TR細胞中的miR-130b表達明顯高于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細胞中的miR-130b表達水平顯著低于inhibitor NC組(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1.The levels of miR-130b in U251 and U251/TR cells (A) and the relative expression of miR-130b in glioma cells after transfected with miR-130b mimics, miR-130b inhibitor or their matched negative controls (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 cells;▲▲P<0.01vsmimics NC group;■■P<0.1vsinhibitor NC group.

圖1RT-qPCR檢測miR-130b在親代U251細胞和耐藥型U251/TR細胞中的表達差異

4 過表達/敲減miR-130b表達對體外膠質(zhì)瘤細胞TMZ治療反應的影響

將U251/TR細胞接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，分為mimics NC組、mimics NC+TMZ組和miR-130b mimics+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，實驗結(jié)束后使用CCK-8法檢測A值，mimics NC組、mimics NC+TMZ組和miR-130b mimics+TMZ組細胞的A值分別為0.945±0.368、0.849±0.231和0.337±0.085，miR-130b mimics+TMZ組的A值顯著低于mimics NC+TMZ組(P<0.01)；使用流式細胞術(shù)檢測3組細胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-130b mimics+TMZ組的凋亡率顯著高于mimics NC+TMZ組(P<0.01),見圖2A。

將U251細胞接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，分為inhibitor NC組、inhibitor NC+TMZ組和miR-130b inhibitor+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，實驗結(jié)束后使用CCK-8法檢測A值，inhibitor NC組、inhibitor NC+TMZ組和miR-130b inhibitor+TMZ組細胞的A值分別為1.462±0.428、0.823±0.247和1.448±0.367，miR-130b inhibitor+TMZ組的A值顯著高于inhibitor NC+TMZ組(P<0.01)；使用流式細胞術(shù)檢測3組細胞凋亡率，結(jié)果顯示, miR-130b inhibitor+TMZ組的凋亡率顯著低于inhi-bitor NC+TMZ組(P<0.01)，見圖2B。

Figure 2.Up-regulation of miR-130b promoted apoptosis induced by TMZ in U251/TR cells (A), while the apoptosis in U251 cells induced by TMZ was inhibited by down-regulation of miR-130b (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimics NC group;▲▲P<0.01vsmimics NC+TMZ group;■■P<0.01vsinhibitor NC group;●●P<0.01vsinhibitor NC+TMZ group.

圖2流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-130bmimics或miR-130binhibitor對體外膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響

5 驗證miR-130b的直接靶基因TNF-α

為了研究miR-130b在膠質(zhì)瘤細胞血管新生中的可能作用機制，通過檢索miRBase數(shù)據(jù)庫獲得hsa-miR-130b序列，并通過運用生物信息學工具RNAhybrid 2.1、TargetScan和PicTar對miR-130b的靶基因進行預測。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)TNF-α與hsa-miR-130b存在潛在的結(jié)合位點，見圖3A。為此，我們進一步應用螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對體外U251細胞中miR-130b對TNF-α的調(diào)控作用進行驗證。

螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和inhibitor NC后細胞螢光素酶活性相比較，在U251細胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和miR-130b inhibitor后的螢光素酶活性值明顯升高(P<0.01)；而共轉(zhuǎn)染Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和miR-130b inhibitor后細胞螢光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和inhibitor NC后的細胞螢光素酶活性值相比較，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3B。

將miR-130b mimics和miR-130b inhibitor分別轉(zhuǎn)染U251/TR和U251細胞后，應用Western blot檢測膠質(zhì)瘤細胞中TNF-α蛋白的表達，結(jié)果表明miR-130b mimics組的U251/TR細胞中TNF-α的表達明顯低于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細胞中的TNF-α表達水平顯著高于inhibitor NC組(P<0.01),見圖3C。以上結(jié)果表明，miRNA-130b可與TNF-α的3’-UTR結(jié)合，TNF-α是miR-130b的直接靶向基因。

Figure 3.Prediction and validation of the target gene of miR-130b. A: the putative miR-130b binding sequences in the 3’-UTR of TNF-α; B: the relative luciferase activity was measured in the U251 cells after co-transfection of TNF-α-3’-UTR-WT or TNF-α-3’-UTR-Mut with miR-130b inhibitor or appropriate negative control; C: the protein level of TNF-α was examined in the U251 cells by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsinhibitor NC group;▲▲P<0.01vsmimics NC group.

圖3生物信息學工具預測及熒光素酶報告檢測系統(tǒng)驗證miR-130b的靶基因

6 過表達/敲減miR-130b表達對膠質(zhì)瘤細胞中NF-κB活性及Bcl-2、XIAP和survivin蛋白表達的影響

將miR-130b mimics和mimics NC轉(zhuǎn)染至U251/TR細胞，同時將miR-130b inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染至U251細胞48 h后，利用EMSA檢測膠質(zhì)瘤細胞中NF-κB活性，結(jié)果顯示，miR-130b mimics組U251/TR細胞中NF-κB活性較mimics NC組明顯減弱(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細胞中NF-κB活性顯著強于inhibitor NC組(P<0.01)，見圖4A。

miR-130b mimics和miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48 h 后，應用Western blot法檢測膠質(zhì)瘤細胞中蛋白表達水平， 結(jié)果表明，miR-130b mimics組U251/TR細胞中的Bcl-2、XIAP和survivin的表達水平明顯低于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細胞中Bcl-2、XIAP和survivin的表達水平顯著高于inhibitor NC組(P<0.01)，見圖4B。

7 NF-κB抑制劑Bay 11-7082對體外膠質(zhì)瘤細胞TMZ治療反應的影響

將U251/TR細胞分為對照組、TMZ組和Bay 11-7082+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，Bay 11-7082作用濃度為5 μmol/L，藥物作用結(jié)束后使用CCK-8法和流式細胞術(shù)分別檢測3組細胞活力和凋亡。

對照組、TMZ組和Bay 11-7082+TMZ組細胞的A值分別為1.049±0.177、0.874±0.080和0.552±0.094，Bay 11-7082+TMZ組的A值顯著低于TMZ組(P<0.01)；如圖5所示，Bay 11-7082+TMZ組的凋亡率顯著高于TMZ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

討 論

膠質(zhì)瘤患者術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移最主要的原因是由于惡性膠質(zhì)瘤細胞異?；钴S的增殖活性和高侵襲性引起。膠質(zhì)瘤細胞失去控制的過度增殖可升高顱內(nèi)壓，從而導致膠質(zhì)瘤患者嚴重的并發(fā)癥-腦疝，對患者生命安全造成嚴重影響。而隨著第2代烷化劑TMZ的出現(xiàn)，使得當前膠質(zhì)瘤的治療取得了長足的進步，然而，僅有不超過一半患者對TMZ等化療藥敏感，使得TMZ對膠質(zhì)瘤患者的生存延長作用十分有限。血腦屏障和膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的獲得性耐藥是制約患者化療效果的關(guān)鍵原因。因此，膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥是當前化療急需解決的難題[8-10]。為研究膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥的具體機制，本研究通過參考既往文獻[11]，利用梯度遞增濃度法建立體外耐TMZ膠質(zhì)瘤細胞株。所建立的耐藥型細胞株對TMZ的IC50值較其親代細胞明顯升高，其RI指數(shù)為8.1，屬中度耐藥；凍存后的U251/TR細胞經(jīng)復蘇后仍能保持生長和傳代；同時U251/TR細胞在脫離TMZ作用后，該細胞株對TMZ的耐藥指數(shù)有所下降，但仍維持于80%～90%之間。以上結(jié)果均表明，本次研究所建立的耐藥細胞株的耐藥性較為穩(wěn)定，適合進行下一步機制研究。

Figure 4.The EMSA analysis for determining NF-κΒ activation in miR-130b-overexpressing U251/TR cells and miR-130b-knockdown U251 cells (A), and Western blot results of endogenous Bcl-2, XIAP and survivin in glioma cells (B). Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsmimics NC group;##P<0.01vsinhibitor group.

圖4轉(zhuǎn)染miR-130bmimics和miR-130binhibitor至膠質(zhì)瘤細胞后，EMSA檢測NF-κB活性，Westernblot法檢測膠質(zhì)瘤細胞中Bcl-2、XIAP和survivin蛋白表達

最新研究表明，miRNAs在腫瘤細胞耐藥過程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，但目前尚未有miR-130b與膠質(zhì)瘤耐藥的相關(guān)性研究報道。為此，本研究探討了miR-130b在親代膠質(zhì)瘤細胞和耐藥型膠質(zhì)瘤細胞中的差異，檢測結(jié)果表明，miR-130b在U251/TR細胞中的表達較U251細胞明顯降低，這種表達差異提示miR-130b可能與膠質(zhì)瘤細胞獲得性耐藥存在一定聯(lián)系，但這種聯(lián)系究竟是通過何種作用方式來實現(xiàn)尚未可知，為此，下一步我們將特異性上調(diào)及下調(diào)miR-130b在膠質(zhì)瘤細胞中的表達來觀察miR-130b對膠質(zhì)瘤細胞生長及凋亡的影響。

CCK-8結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤U251細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor可有效削弱TMZ對膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用。另外，而上調(diào)miR-130b在膠質(zhì)瘤細胞中的表達后可有效增強TMZ對體外膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制作用，提示miR-130b在體外膠質(zhì)瘤細胞生長中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。另外，進一步研究miR-130b與體外膠質(zhì)瘤細胞凋亡的實驗結(jié)果表明，下調(diào)miR-130b在體外U251細胞中的表達可有效抑制細胞凋亡，而上調(diào)miR-130b的表達可增強TMZ對膠質(zhì)瘤細胞的凋亡誘導作用，從而表明miR-130b可能作為耐藥型膠質(zhì)瘤細胞對TMZ治療的增敏劑。然而，關(guān)于miR-130b調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞獲得性耐藥的信號傳導機制尚不清楚。

Figure 5.The apoptosis in U251/TR cells induced by TMZ was promoted by the addition of Bay 11-7082. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTMZ group.

圖5流式細胞術(shù)檢測Bay11-7082對TMZ誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響

TNF-α在大量良性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的作用[12]；最新證據(jù)顯示，TNF-α在膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平要顯著高于正常腦組織，同時與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[13]；TNF-α還可通過激活ERK、JNK、Akt和NF-κB等下游信號通路，從而促進腫瘤細胞生長并誘導腫瘤細胞耐藥[14]；另外，TNF-α還可誘導ABCG2 在腫瘤細胞中表達，增強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗作用[15]。然而，迄今為止尚未有miR-130b和TNF-α的生物學功能研究報道。在我們的研究中，下調(diào)miR-130b的表達可促進TNF-α在膠質(zhì)瘤細胞中的表達，而TNF-α在miR-130b高表達的U251細胞中的表達水平顯著降低。此外，螢光素酶報告實驗進一步證實，miR-130b直接靶向調(diào)控TNF-α。研究表明，NF-κB在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并且在人腦膠質(zhì)瘤細胞中，NF-κB 可以通過誘導MGMT等凋亡抑制蛋白的表達，從而誘導膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑耐藥[16]。TNF-α作為NF-κB的主要活化因子之一，TNF-α激活NF-κB的作用機制已有詳盡的研究[17]。本次研究表明，miR-130b在膠質(zhì)瘤細胞中的異位表達可抑制NF-κB活性，而敲除miR-130b的表達可增強NF-κB活性；此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達下調(diào)可增加NF-κB的下游蛋白，如Bcl-2、XIAP和survivin的表達，這些凋亡抑制蛋白與腫瘤細胞耐藥關(guān)系密切[18]；另外，使用Bay 11-7082特異性阻斷NF-κB信號通路可增強TMZ對耐藥型膠質(zhì)瘤細胞的凋亡誘導作用，進一步強調(diào)NF-κB信號通路在膠質(zhì)瘤細胞對TMZ獲得性耐藥中的重要作用。至此，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞耐藥的調(diào)控機制是通過TNF-α/NF-κB這一信號通道來實現(xiàn)，TNF-α/NF-κB信號通道可誘導下游凋亡抑制蛋白的表達，進而促進膠質(zhì)瘤細胞耐藥性，miR-130b/TNF-α/NF-κB信號通路可能在調(diào)控膠質(zhì)瘤對TMZ獲得性耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在當前研究背景下，我們發(fā)現(xiàn)在U251細胞中，miR-130b可直接靶向調(diào)控 TNF-α，從而進一步調(diào)控NF-κB信號通道而控制膠質(zhì)瘤對TMZ的獲得性耐藥。從機理上看，下調(diào)miR-130b可促進TNF-α的高水平表達，并有助于激活NF-κB并促進其下游蛋白Bcl-2、XIAP和survivin的表達。但本文的不足在于僅用一種膠質(zhì)瘤細胞進行實驗，miR-130b是否在其它膠質(zhì)瘤細胞耐藥中發(fā)揮一定作用還未明確；同時TNF-α在調(diào)控體外U251/TR細胞耐藥中發(fā)揮主導作用還是部分作用尚未可知；另外，TMZ在誘導膠質(zhì)瘤細胞耐藥過程中是直接還是間接調(diào)控miR-130b還有待進一步實驗明確?？傊琺iR-130b/TNF-α/NF-κB通路可能是未來膠質(zhì)瘤治療的具體作用靶點，從而在揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制及治療上具有一定積極意義。