陳 麗， 劉華勇， 駱文志， 陳嘉偉， 吳 義， 黃志宏， 劉升明

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510632)

NLRP3 炎癥小體是宿主細胞識別病原微生物、啟動固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵炎癥信號平臺，位于細胞胞漿，由NLRP3 N端的pyrin結(jié)構(gòu)域(pyrin domain, PYD)與接頭蛋白 ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain)和caspase-1相互結(jié)合形成[1]。目前認為， NLRP3 炎癥小體的激活調(diào)控分為2個步驟[1-2]： 第1步啟動階段，經(jīng)NF-κB或激活A(yù)P-1等活化途徑，上調(diào) NLRP3 和其它組分的 mRNA 表達，再進行翻譯后修飾；第2步激活階段,促進 NLRP3/ASC/pro-caspase-1 蛋白復(fù)合物組裝， pro-caspase-1 自剪切成活化形式，活化的 caspase-1 將白細胞介素1β和白細胞介素18前體剪切活化釋放到胞外，引起炎癥發(fā)生，甚至細胞死亡?；钚匝醮?reactive oxygen species, ROS)、ATP、病毒、支原體及其它病原體和晶體顆粒等都可以激活 NLRP3 炎癥小體[2]。但是，這些不同的刺激物激活 NLRP3 炎癥小體的機制尚不清楚。有研究顯示 NLRP3 炎癥小體參與哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)和肺纖維化等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展[1, 3-4]。

為了探討氣道上皮細胞內(nèi) NLRP3 炎癥小體是否直接參與 SO2及其衍生物引起的氣道炎癥反應(yīng)，本文擬使用不同濃度 SO2衍生物刺激支氣管上皮細胞16HBE，并通過RNA干擾技術(shù)沉默NLRP3基因及使用ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cys-teine,NAC)預(yù)處理 16HBE 細胞等方法，觀察 SO2衍生物對 NLRP3 炎癥小體活化的影響，為 NLRP3 炎癥小體作為呼吸系統(tǒng)抗炎治療新靶點提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗試劑和材料

1.1細胞株 16HBE 細胞株由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科蔡興東博士饋贈。

1.2主要試劑 NaHSO3和Na2SO3(上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司)；MTT(Sigma)；NAC和ROS試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗NLRP3、caspase-1 p20和GAPDH 抗體(Cell Signaling)；IL-1β ELISA 試劑盒(R&D)；化學(xué)合成NLRP3小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA；廣州銳博生物科技有限公司)； Lipofectamine 2000(Invitrogen)。

2 實驗方法

2.1細胞分組 將細胞分為對照(control)組和 SO2衍生物干預(yù)組，均使用含 10% FBS 的高糖 DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

2.2SO2衍生物的配制 參考Li等[9]的實驗方法，將 Na2SO3和NaHSO3的混合溶液(二者物質(zhì)的量比為 3∶1)稀釋成不同濃度作用于16HBE細胞12 h。

2.3MTT 法檢測不同濃度SO2衍生物對16HBE細胞的活力影響 收集對數(shù)期 16HBE 細胞，用含有 10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基調(diào)制成單細胞懸液，以2.5×107/L的細胞密度接種于 96 孔板上；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細胞貼壁換液。將配制好的 SO2衍生物混合溶液分別稀釋為 0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L 和 5 mmol/L 6個濃度，每個濃度3個復(fù)孔。觀察12 h，去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基100 μL后加入 0.5 g/L MTT 10 μL，37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育4 h；去上清，每孔加入100 μL DMSO，放置在微量振蕩器上振蕩 10 min；最后在酶標儀上使用 570 nm波長測吸光度(A)值。

2.4流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平 將5×105個細胞接種至6孔板中，24 h后去培養(yǎng)基，PBS 洗2次，分別加入含有 0.5 mmol/L、 2 mmol/L 和 4 mmol/L SO2衍生物和 10% FBS的 DMEM，設(shè)定空白對照組和不同濃度 SO2衍生物組，觀察12 h；消化細胞后用 PBS 洗 1 次，1 000 r/min 離心 5 min,去 PBS 無血清DMEM 重懸，對照組分出 200 μL不染色； PBS 清洗 2 次，1 000 r/min 離心 5 min，去上清；加入 DCFH-DA 染色劑 200 μL，混勻后避光，37 ℃ 孵育 20 min，間斷混勻；上流式細胞儀檢測。

2.5轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的16HBE細胞接種于 6 孔板，干預(yù)組加入 2 mmol/L SO2衍生物刺激 24 h，待細胞融合至 30%～50%，去上清液，用 PBS 清洗 2 次；將含有NLRP3 siRNA 和 Lipofectamine 2000 混合的無血清 DMEM 滴入 6 孔板的待轉(zhuǎn)染細胞中，放置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 6 h；去上清，用 PBS 清洗 2 次；加入新鮮含 10% FBS DMEM 培養(yǎng)基 2 mL，轉(zhuǎn)染 24 h 后再加入刺激物 2 mmol/L SO2衍生物，觀察 12 h。

2.6NAC干預(yù)實驗 參考Huang 等[11]的實驗方法，使用5 mmol/L NAC 孵育1 h后，加入2 mmol/L SO2衍生物刺激 16HBE 細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng) 12 h，收集細胞行相關(guān)指標檢測。

2.7Western blot 檢測 NLRP3 炎癥小體蛋白表達 將對數(shù)生長期的 16HBE細胞接種至 6 孔板中，待細胞融合至 60% 時更換為無血清培養(yǎng)，24 h 后分別加入不同濃度的 SO2衍生物刺激，觀察 12 h。去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷 PBS 緩沖液，清洗 3 次，每孔加入 100 μL預(yù)冷含有 PMSF 的細胞裂解液(1∶100)，冰上裂解；將裂解液用超聲細胞粉碎機繼續(xù)裂解細胞后放入低溫高速離心機，4 ℃、12 000 r/min，30 min；收集上清液至 EP 管中，取少量用于 BCA 蛋白檢測，余分裝，-80 ℃ 保存。按照 BCA 試劑盒說明測定總蛋白濃度，將檢測后的蛋白樣品變性后用于 SDS-PAGE。變性后的蛋白樣品通過 10% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，隨后進行常規(guī)Western blot實驗。

2.8ELISA檢測細胞上清液中IL-1β濃度 同2.5和2.6細胞準備，上清液分別移入1.5 mL EP 管中，放置于 -80 ℃ 保存。使用前將所有試劑平衡至室溫；根據(jù) R&D ELISA 試劑盒說明書配置標準品及測試。每個樣品設(shè) 3 個復(fù)孔。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

本文所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，方差齊的使用單因素方差分析(one-way ANOVA)。所有數(shù)據(jù)由 SPSS 16.0 軟件進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度 SO2 衍生物對細胞活力的影響

本實驗使用不同濃度的 SO2衍生物分別刺激 16HBE 細胞后，觀察 12 h。通過MTT 檢測方法測定細胞活力。結(jié)果顯示，低濃度(0.5和1 mmol/L)的 SO2衍生物對 16HBE 細胞無細胞毒性，中、高濃度(2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L和5 mmol/L)的 SO2衍生物刺激 16HBE 細胞后，細胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The viability of 16HBE cells stimulated with various concentrations of SO2derivatives for 12 h was determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同濃度SO2衍生物對16HBE細胞活力的影響

2 SO2衍生物激活 16HBE 細胞的 ROS生成

我們根據(jù) MTT 結(jié)果選定 0.5 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L 的 SO2衍生物分別刺激 16HBE 細胞 12 h，結(jié)果顯示，2和4 mmol/L 濃度組的 ROS 水平顯著升高(P<0.05)；與對照組比較，0.5 mmol/L濃度組ROS有升高，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

3 不同濃度 SO2 衍生物對細胞 NLRP3 炎癥小體表達的影響

與正常對照組比較，各濃度組的 SO2衍生物刺激 16HBE 細胞12 h，細胞內(nèi)的 NLRP3蛋白水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；2和4 mmol/L 濃度組細胞內(nèi)的caspase-1 p20 蛋白和細胞上清液中 IL-1β 的濃度明顯升高(P<0.05)，0.5 mmol/L 濃度組 caspase-1 p20和IL-1β 的表達稍有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

4 SO2 衍生物通過NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)IL-1β生成

將2 mmol/L的 SO2衍生物作為 siRNA 實驗刺激濃度。結(jié)果顯示,與2 mmol/L 干預(yù)組比較，NLRP3 siRNA 組細胞內(nèi)的 NLRP3和caspase-1 p20 蛋白水平明顯降低(P<0.05)，且細胞上清液中 IL-1β 的濃度明顯下降(P<0.05)，見圖4。

5 SO2 衍生物作用于轉(zhuǎn)染 NLRP3 siRNA 的16HBE 細胞后 ROS 的變化情況

與正常組比較，不論是否對 16HBE 細胞轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA，經(jīng) 2 mmol/L SO2衍生物刺激的細胞內(nèi)ROS均明顯升高(P<0.05)；但是與 2 mmol/L SO2衍生物干預(yù)組相比，使用2 mmol/L SO2衍生物刺激后轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA的 16HBE細胞內(nèi) ROS 水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖5。

Figure 2.Treatment with different concentrations of SO2derivatives for 12 h induced reactive oxygen species (ROS) production. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖2不同濃度SO2衍生物刺激16HBE細胞12h細胞內(nèi)ROS生成的變化

Figure 3.The protein expression of NLRP3 and caspase-1 p20 (A) and the level of IL-1β (B) in the 16HBE cells stimulated with different concentrations of SO2derivatives for 12 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖3不同濃度SO2衍生物對細胞NLRP3和caspase-1p20蛋白表達及上清液IL-1β濃度的影響

Figure 4.The protein expression of NLRP3 and caspase-1 p20 (A) and the level of IL-1β (B) in the 16HBE cells stimulated with 2 mmol/L SO2derivatives after transfected withNLRP3 siRNA. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSO2derivatives group.

圖416HBE細胞轉(zhuǎn)染NLRP3siRNA后SO2衍生物對細胞NLRP3和caspase-1p20蛋白表達及上清液IL-1β濃度的影響

6 SO2 衍生物經(jīng)過 ROS 作用于 NLRP3 炎癥小體

與正常組比較， 2 mmol/L SO2衍生物干預(yù)組及 NAC 組中，細胞內(nèi)的 NLRP3和caspase-1 p20 蛋白表達及細胞上清液中 IL-1β 的濃度均明顯升高(P<0.05)；與2 mmol/L SO2衍生物干預(yù)組比較， NAC 組細胞內(nèi)的 NLRP3和caspase-1 p20 蛋白表達及細胞上清液中 IL-1β的濃度下調(diào)(P<0.05)，見圖6。

討 論

氣道炎癥是多種肺部疾病的共同特點，常常與有毒顆?；驓怏w的顯著暴露有關(guān)。SO2是一種全球性大氣污染物，長時間暴露于 SO2中可引起多種氣道炎癥性疾病，高濃度吸入可引起肺損傷，甚至危及生命[5, 7, 10]。既往研究已經(jīng)證實 4.3 mg/m3的SO2可引起呼吸道炎癥，在體內(nèi)研究中也觀察到實驗動物氣道阻力的增加[8]; Tam等[7]研究發(fā)現(xiàn)慢性暴露在含有較高SO2的酸性火山空氣污染源，與夏威夷學(xué)齡兒童咳嗽和小氣道功能受損(肺功能FEV1/FVC<0.8)有直接關(guān)系；一項回顧性分析共同存在心血管疾病 COPD 患者病情加重住院原因的研究結(jié)果顯示，入院前患者暴露在至少 30 d或更長時間的大氣污染中，且大氣中 SO2的含量與 COPD 急性加重的相對風(fēng)險(relative risk,RR)呈顯著相關(guān)性(RR 1.04～1.05;P<0.05)[6]；Yun等[12]在觀察小鼠心臟和肺部損害時發(fā)現(xiàn)，SO2可以引起氧化應(yīng)激、 DNA 損傷和膜通道改變，炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β mRNA 等的表達水平明顯增加，但具體機制仍不清楚。本研究也觀察到 SO2刺激 16HBE 細胞后細胞內(nèi) ROS 明顯升高,細胞外 IL-1β 分泌增加，說明有氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)生。

越來越多研究證實了氣道炎癥與吸入污染物或過敏原后支氣管上皮出現(xiàn)的免疫反應(yīng)有關(guān)系[13-14]。NLRP3 炎癥小體過度激活可導(dǎo)致組織損傷，使得慢性炎癥持續(xù)[1]。因此，作為固有免疫反應(yīng)和炎癥之間重要橋梁的 NLRP3 炎癥小體也備受人們關(guān)注。有研究使用可吸入性顆粒誘導(dǎo)野生型小鼠和NLRP3 基因敲除小鼠建立氣道炎癥模型，結(jié)果顯示小鼠肺內(nèi) IL-1β 表達的升高依賴于 NLRP3，且小鼠胸內(nèi)淋巴結(jié)數(shù)目明顯增加[13]。我們前期研究觀察到 COPD 患者支氣管上皮細胞 NLRP3 和 caspase-1 蛋白表達較正常組增高；體外研究顯示生物燃料煙霧提取物激活支氣管上皮細胞內(nèi)的 NLRP3 炎癥小體，并促進炎癥因子 IL-1β和CXCL-8 釋放[15]。這些研究基本都是以含有顆粒性狀物質(zhì)為干預(yù)組，來說明 NLRP3 炎癥小體參與了氣道炎癥的發(fā)生；但對于揮發(fā)性物質(zhì)或者氣體的相關(guān)研究甚少。

Figure 5.The producttion of intracellular ROS in the 16HBE cells stimulated with 2 mmol/L SO2derivatives after transfected withNLRP3 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖516HBE細胞轉(zhuǎn)染NLRP3siRNA后SO2衍生物對細胞內(nèi)ROS的影響

Figure 6.The protein expression of NLRP3 and caspase-1 p20 (A) and the level of IL-1β (B) in the 16HBE cells stimulated with 2 mmol/L SO2derivatives after blocked with NAC. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSO2derivatives group.

圖6使用NAC干預(yù)16HBE細胞后SO2衍生物對細胞NLRP3和caspase-1p20蛋白表達及IL-1β濃度的影響

為了觀察揮發(fā)性物質(zhì)或者氣體是否激活 NLRP3 炎癥小體？本研究使用不同濃度的 SO2衍生物為干預(yù)組觀察支氣管上皮細胞內(nèi) NLRP3 炎癥小體的變化。結(jié)果顯示，在中、高濃度組細胞內(nèi)NLRP3和caspase-1 p20的蛋白表達量增加，上清液中IL-1β 分泌明顯增加，說明SO2衍生物可以激活 NLRP3 炎癥小體促進炎癥因子釋放。為了探討 SO2衍生物對NLRP3 炎癥小體及 IL-1β 表達的影響及可能性機制。我們使用 siRNA 沉默 16HBE 細胞NLRP3基因后，caspase-1 p20 和 IL-1β 表達均明顯減少，但是細胞內(nèi) ROS 沒有明顯變化。為了進一步觀察 SO2衍生物是否經(jīng) ROS 作用于 NLRP3炎癥小體，我們使用NAC提前干預(yù)16HBE細胞， NLRP3和caspase-1 p20 蛋白和 IL-1β 表達明顯下降，但是仍然高于對照組。以上結(jié)果說明 SO2衍生物激活 NLRP3 炎癥小體并不完全經(jīng)過 ROS，推測 SO2進入細胞后除了可以引起細胞內(nèi) ROS 增加外，自身可能與 ATP 等物質(zhì)一樣作為內(nèi)源性危險信號損傷相關(guān)的分子模式(damage- associated molecular patterns, DAMPs)直接作用于細胞內(nèi) NLRP3 影響炎癥小體活性，進而影響炎癥因子釋放。本研究為我們進一步探討 SO2與 NLRP3 炎癥小體的蛋白修飾之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為 NLRP3 炎癥小體作為新的氣道炎癥新靶點提供理論支撐。