張 萍， 何曉剛， 徐曉丹， 張 露， 劉 雪， 劉亞坤， 姜 玉， 汪思應(yīng)， 李菲菲△

(1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 安徽 合肥 230032； 2上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院， 上海 201318)

乳腺癌是影響全球女性最普遍的腫瘤之一，乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移引起顯著的病死率[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年美國(guó)報(bào)告的女性浸潤(rùn)性乳腺癌病例數(shù)為231 840例，其中40 290例死亡[2]。乳腺癌侵襲性轉(zhuǎn)移的機(jī)制有很多，但近期大多數(shù)研究結(jié)果表明，在乳腺癌的侵襲性轉(zhuǎn)移過(guò)程中乳腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)起重要作用[3-5]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)細(xì)胞形態(tài)由上皮細(xì)胞形態(tài)變成梭形間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附和極性喪失，并且伴有上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)降低，神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表達(dá)增加，遷移和侵襲能力增加，加強(qiáng)了原發(fā)腫瘤的傳播[6]。腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生是由細(xì)胞、分子和腫瘤微環(huán)境共同參與的過(guò)程，不同的信號(hào)通路如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、Notch和Wnt信號(hào)均可誘導(dǎo)EMT,它們的活性影響EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[7]。大量證據(jù)表明乳腺癌是一種侵襲性腫瘤，具有較高的EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)移能力[8],探討EMT的發(fā)生機(jī)制對(duì)于了解乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要作用。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)是一種成骨細(xì)胞和骨組織形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[9],它通過(guò)結(jié)合成骨細(xì)胞特異性元件2(osteoblast-specific element 2，OSE2)調(diào)控幾種與骨基質(zhì)重建有關(guān)基因的表達(dá)[10-11]。Runx2及其靶基因在乳腺癌組織中高度表達(dá)，并且在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起著重要作用[12]。由于腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)源于EMT使腫瘤細(xì)胞從其起源部位形成多步驟的擴(kuò)散過(guò)程，而EMT的發(fā)生使上皮細(xì)胞失去與周?chē)h(huán)境的聯(lián)系并獲得一種間充質(zhì)表型, 協(xié)助腫瘤細(xì)胞從起源部位進(jìn)入血液循環(huán)并遷移到遠(yuǎn)處的器官[13-14]，那么Runx2是否能夠通過(guò)發(fā)生EMT使得乳腺癌細(xì)胞突破基底膜、定植到骨，從而引起乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移？為了明確Runx2與乳腺細(xì)胞EMT的關(guān)系，我們用RNA干擾技術(shù)建立了穩(wěn)定敲減Runx2表達(dá)的高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，觀察比較了該細(xì)胞株的EMT相關(guān)表型和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

材 料 和 方 法

1 主要細(xì)胞、試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由美國(guó)合作實(shí)驗(yàn)室引進(jìn),用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)。Runx2 RNA干擾慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司)；胎牛血清(天津康源生物技術(shù)公司)；嘌呤霉素(Sigma)；TRIzon Reagent(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。PCR擴(kuò)增儀(Biometra)；熒光倒置顯微鏡(ZEISS)；細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀(Thermo)；瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀FluorChem(上海晶檀生物有限公司)。

2 主要方法

2.1Runx2基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及包裝 由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司以 GV248 為載體，根據(jù)人Runx2 基因序列(NM_001024630) 設(shè)計(jì)并合成3條靶向短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA) 序列 [shRNA1 (5’-TACCTATCACAGAGCAATT-3’)、shRNA2 (5’-CAGTGATTTAGGGCGCATT-3’)和shRNA3 (5’-GCACTCCATATCTCTACTA-3’)]及1條陰性對(duì)照(control)shRNA序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，并以此構(gòu)建并包裝3種慢病毒載體及空載慢病毒載體。

2.2慢病毒感染 感染前一天將正常對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后，離心，計(jì)數(shù)，按每孔細(xì)胞以5×104個(gè)接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到45% 時(shí)開(kāi)始病毒感染。病毒的MOI值為10(病毒滴度為1×107)感染效果最佳。棄去原培養(yǎng)基，將440 μL DMEM+10 μL Runx2-shRNA+50 μL polybrene加入1.5 mL EP管混勻后加入相應(yīng)的孔中。12 h后，將培養(yǎng)基換成含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)。接著用濃度為0.5 mg/L的嘌呤霉素篩選，挑單個(gè)細(xì)胞克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立低表達(dá)Runx2的穩(wěn)定的MDA-MB-231細(xì)胞系。

2.3基因表達(dá)檢測(cè) RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中Runx2的mRNA表達(dá)水平。Runx2的上游引物序列為 5’-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3’，下游引物序列為5’-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3’(238 bp)；β-actin的上游引物序列為5’-ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3’，下游引物序列為5’-ACAGGAAGTCCCTTGCCATC-3’。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞棄去原培養(yǎng)基，每小皿加入1 mL TRIzon Reagent，槍頭反復(fù)吹打裂解細(xì)胞后移入1.5 mL EP管,分次加入氯仿、異丙醇和75% DEPC無(wú)水乙醇，提取RNA。取適量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為:template RNA 3 μg，Oligo (dT) prime 1 μL，加入DEPC水至總體積為12 μL;混勻，金屬浴65 ℃ 5 min后，加入5×reaction buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor(20 U)1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL和RevertAid M-MuLV RT (200 U) 1 μL，混勻，總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。PCR體系為：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL， 1×forward primer 1 μL, reverse primer 1 μL, template DNA 2 μL, DEPC水 8.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94 ℃ 2 min;變性 94 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，終延伸 72 ℃ 2 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀拍片，計(jì)算不同條帶灰度值，不同組間進(jìn)行比較。

2.4Western blot檢測(cè)Runx2和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，RIPA裂解提取總蛋白、SDS-PAGE分離及轉(zhuǎn)膜、封閉及 I 抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜、次日TBST洗膜3次，每次10 min,再加入II 抗(1∶5 000)，搖床上室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)，并測(cè)定灰度值。

2.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞饑餓處理12 h。提前將基質(zhì)膠于冰上融化成液態(tài)，將150 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基和50 μL的基質(zhì)膠混勻。每個(gè)小室上室均勻鋪30 μL稀釋的基質(zhì)膠后，將小室置于24孔板里于孵箱中30 min，使膠凝固。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化并離心，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×109/L。待小室的膠凝固后，每組細(xì)胞設(shè)2個(gè)復(fù)孔，每孔3×105cells，小室上室無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)體系每孔200 μL，加入相應(yīng)體積的細(xì)胞懸液，下室加500 μL完全的DMEM培養(yǎng)基。將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收板。棄去上室培養(yǎng)液，棉簽輕擦去上室中未穿過(guò)膜的細(xì)胞。加4%多聚甲醛結(jié)晶紫固定并染色2 h后。PBS清洗上室3次，室溫干燥后，顯微鏡下觀察、拍攝圖片，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將水浴鍋設(shè)置為60 ℃(維持瓊脂糖膠呈液態(tài))，按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM完全培養(yǎng)基(含20% 胎牛血清和2%青、鏈霉素)充分混合制備下層膠，每孔取1.5 mL鋪于6孔板中(槍頭稍留點(diǎn)，不全打完，避免產(chǎn)生氣泡)，封口膜封板，于平整冰面上冷卻凝固(約45 min)。在等待下層膠凝固的時(shí)間中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化離心，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/L。鋪上層膠,每孔3 000 cells，每組細(xì)胞設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取900 μL細(xì)胞懸液加入到600 μL 2×DMEM完全培養(yǎng)基中混勻，再加1.5 mL 0.7%的瓊脂糖，充分混勻后取1 mL后注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中。冷卻凝固后，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，保持瓊脂的濕潤(rùn)度。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。收板，顯微鏡下觀察、拍攝圖片，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間均數(shù)的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功建立Runx2表達(dá)抑制的乳腺癌細(xì)胞系

慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)，并用嘌呤霉素篩選2～3周，直至熒光倒置顯微鏡下觀察所有的細(xì)胞均能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光時(shí)，說(shuō)明成功建立了穩(wěn)定敲低Runx2表達(dá)的細(xì)胞株，見(jiàn)圖1。敲低Runx2表達(dá)的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株(Runx2-shRNA3)中Runx2的mRNA和蛋白含量明顯低于常規(guī)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞(P<0.05)，提示在本實(shí)驗(yàn)中 Runx2-shRNA3組干擾效率好，并應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中；未轉(zhuǎn)染(control)組和陰性對(duì)照(NC)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

2 敲減Runx2表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程

與正常MDA-MB-231細(xì)胞相比，敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞之間變得更加緊密，呈現(xiàn)上皮樣改變,這一現(xiàn)象提示敲減MDA-MB-231細(xì)胞中Runx2的表達(dá)可能抑制EMT過(guò)程，促使細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞上皮化，見(jiàn)圖3A;隨后我們采用Western blot檢測(cè)不同組中EMT相關(guān)標(biāo)志物 E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin蛋白明顯高于常規(guī)MDA-MB-231細(xì)胞和轉(zhuǎn)染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231細(xì)胞(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3B;敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞的N-cadherin、β-catenin和MMP-9蛋白水平明顯低于常規(guī)MDA-MB-231細(xì)胞和轉(zhuǎn)染慢病毒陰性載體的MDA-MB-231細(xì)胞(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3B。

Figure 1.Knock-down ofRunx2 expression by lentiviral vector infection in MDA-MB-231 cells (×200).

圖1建立穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光的乳腺癌細(xì)胞系

Figure 2.The mRNA and protein expression of Runx2 with or without infection with lentiviral vector in MDA-MB-231 cells detected by RT-PCR and Western blot. A: the mRNA expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group; B: the protein expression of Runx2 was obviously inhibited in Runx2-shRNA3 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖2成功建立Runx2表達(dá)抑制的乳腺癌細(xì)胞系

Figure 3.Mesenchymal-to-epithelial transition of MDA-MB-231 cells after down-regulating the expression ofRunx2. A: the cell morphological changes were observed under reverted microscope (×200); B: the relative protein expression of Runx2 and the EMT markers E-cadherin, N-cadherin, β-catenin and MMP-9 in the MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖3Runx2低表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程

3 抑制Runx2表達(dá)可以抑制高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

通過(guò)以上研究我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Runx2的表達(dá)可致MDA-MB-231細(xì)胞的EMT也受到抑制，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了敲減Runx2表達(dá)后細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力是否也受到了抑制。通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)敲低Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞與正常MDA-MB-231細(xì)胞相比，侵襲能力明顯下降(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4A，說(shuō)明抑制Runx2表達(dá)可以抑制高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

通過(guò)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)了敲減Runx2表達(dá)后細(xì)胞的非錨定生長(zhǎng)能力，發(fā)現(xiàn)敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞與正常MDA-MB-231細(xì)胞相比，細(xì)胞形成集落的數(shù)目以及體積明顯降低(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4B,說(shuō)明抑制Runx2表達(dá)可以抑制高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的非錨定生長(zhǎng)能力，降低了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，進(jìn)而影響了腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

討 論

Runx2是屬于Runx基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，有一個(gè)保守的Runt DNA 結(jié)合域，編碼與果蠅同源的蛋白[15]。最初，Runx2被認(rèn)為是骨骼發(fā)育的一個(gè)主要的調(diào)節(jié)因子[16]。迄今為止，大量的證據(jù)表明Runx2和乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。Runx2高表達(dá)于更傾向骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系和乳腺原發(fā)組織中[18-19]。有證據(jù)表明在乳腺癌細(xì)胞中，Runx2能夠調(diào)節(jié)與骨轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌降解細(xì)胞基質(zhì)，破壞基底膜侵入血管或淋巴管，有利于腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位的定植[20-21]。而上皮間充質(zhì)化是惡性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中腫瘤獲得浸潤(rùn)、遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制[22]。EMT的發(fā)生是上皮細(xì)胞通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞和微環(huán)境改變獲得間充質(zhì)表型，比如上皮標(biāo)志物的降低，間充質(zhì)樣標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞骨架的重組和基底膜的降解導(dǎo)致細(xì)胞間連接丟失，從而促進(jìn)這些細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力[3]。

Figure 4.Inhibition ofRunx2 expression decreased the invasion ability of high invasive metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells. A: the invasion ability of MDA-MB-231 cells was inhibited afterRunx2 expression knock-down; B: inhibition ofRunx2 expression inhibited anchorage-independent growth of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4抑制Runx2表達(dá)可以抑制高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

因此，我們推測(cè)Runx2除了對(duì)腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移骨定植和基底膜突破發(fā)揮作用外，是否能夠參與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而最終影響細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

本研究中我們選取Runx2表達(dá)水平較高的MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染敲減Runx2表達(dá)的慢病毒載體。通過(guò)Western blot和RT-PCR驗(yàn)證了Runx2的敲減效率，結(jié)果顯示敲減Runx2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白被誘導(dǎo)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白被明顯抑制，降解細(xì)胞基底膜的蛋白酶MMP-9被抑制，參與誘導(dǎo)EMT的經(jīng)典WNT信號(hào)通路的β-catenin蛋白表達(dá)被抑制。這些結(jié)果表明敲低Runx2的表達(dá)能夠抑制EMT。同時(shí)我們通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾Runx2可抑制細(xì)胞EMT的過(guò)程，從而抑制了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。我們的研究提示，抑制Runx2的表達(dá)可以有效地干擾侵襲性較高的乳腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，從而對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力起到抑制作用。但Runx2通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活下游何種蛋白來(lái)影響EMT的過(guò)程仍在進(jìn)一步研究中，我們初步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一過(guò)程可能與一種重要的細(xì)胞因子——TGF-β有關(guān)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。本研究為今后以Runx2為核心，發(fā)現(xiàn)有效治療靶點(diǎn)，干預(yù)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了重要的思路和研究方向。