李清揚(yáng)， 胡 偉， 宋嬋嬋， 李亮平

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床腫瘤研究所， 廣東 廣州 510630)

近年來，用腫瘤抗原特異性T細(xì)胞開展腫瘤過繼細(xì)胞治療在臨床試驗(yàn)中取得了明顯療效。目前這一腫瘤治療新策略已得到了廣泛的重視，具有重大應(yīng)用前景[1-3]。腫瘤抗原蛋白質(zhì)中的抗原肽需要經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的切割以及一系列處理加工，形成9～14個(gè)氨基酸殘基的短肽(抗原表位)，與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)肽槽結(jié)合并被提呈轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，T細(xì)胞借助多樣性的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)識(shí)別各種對(duì)應(yīng)的MHC/肽復(fù)合體[4]。人類的MHC分子稱為人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。

用克隆的腫瘤抗原特異性TCR 修飾T細(xì)胞，將普通T細(xì)胞改造為抗癌T細(xì)胞，靶向腫瘤抗原表位，可以治療各種腫瘤(TCR-T細(xì)胞治療)。腫瘤抗原表位作為TCR識(shí)別的靶標(biāo)，是腫瘤免疫治療研發(fā)的基礎(chǔ)。因此，建立腫瘤抗原表位的快速鑒定技術(shù)對(duì)腫瘤免疫治療具有重要意義。然而傳統(tǒng)抗原表位的鑒定方法需要借助復(fù)雜的技術(shù)分析HLA/肽復(fù)合物與TCR特異性結(jié)合產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，耗時(shí)耗力。隨著HLA分子結(jié)構(gòu)學(xué)和計(jì)算機(jī)算法的進(jìn)展，許多研究建立了以西方人常見的HLA-A2為基礎(chǔ)的MHC/肽親和力預(yù)測(cè)技術(shù)，簡(jiǎn)化了抗原表位的鑒定方法，但針對(duì)中國(guó)人常見的HLA分子(如A11和A24等)的研究較少。

本研究選擇3種常見的腫瘤/睪丸抗原(cancer/testis antigen, CTA) NY-ESO、MAGE-A1和KK-LC-1作為研究對(duì)象，選擇中國(guó)人常見的HLA I 類分型，借助MHC/肽結(jié)合預(yù)測(cè)技術(shù)建立中國(guó)人常見的HLA I 類限定的抗原表位預(yù)測(cè)方法，通過分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)快速驗(yàn)證KK-LC-1抗原預(yù)測(cè)的結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)技術(shù)為快速有效地鑒定腫瘤抗原表位提供了新途徑，為下一步克隆特異性TCR基因和TCR-T細(xì)胞治療提供了參考資料。

材 料 和 方 法

1 外周血白細(xì)胞

為了選擇合適的HLA血液供者，本研究召集6名年齡20～35歲無(wú)傳染性疾病的中國(guó)志愿者。根據(jù)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，所有招募的志愿者均簽署知情同意書。用SBT 技術(shù)對(duì)志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)進(jìn)行HLA分型。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、青霉素、 鏈霉素和L-谷氨酰胺購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司；人細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(interleukin-2, IL-2)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophoge colony-stimulating factor, GM-CSF)、IL-4、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-1β和IL-6購(gòu)自PeproTech；ELISPOT試劑盒和人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自中國(guó)達(dá)科為生物技術(shù)公司；流式細(xì)胞分析用抗人抗體[CD83-PE/CY5(305310)、CD86-APC(305412)、CD3-FITC(300406)、 CD4-APC(300514)、CD8-APC/Cy7(301016)和 CD137-PE(309804)]購(gòu)自Biolegend。

3 主要方法

3.1腫瘤抗原表位的預(yù)測(cè) 根據(jù)2013年中華骨髓庫(kù)發(fā)布的《中國(guó)常見及確認(rèn)的HLA等位基因表(CWD)》[5]，中國(guó)人群中>1%的HLA等位基因有35個(gè)(頻率大于10%有6個(gè)等位基因：A*11:01，20.9%；C*01:02，15.9%；A*24:02， 15.5%；C*07:02，15.2%；A*02:01，12.0%；B*46:01，10.3%)。實(shí)驗(yàn)選定這35個(gè)常見的HLA等位基因，為了縮小表位篩選范圍和防止漏篩，用NetMHC 4.0以及NetMHCpan 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/ser-vices/NetMHC/)MHC/肽結(jié)合分析軟件，對(duì)MAGE-A1、NY-ESO和KK-LC-1的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行HLA I型抗原表位和親和力的預(yù)測(cè)。選擇的參數(shù)為：表位的長(zhǎng)度設(shè)定為9mer-11mer，肽的排序(Rank值)按MHC/肽結(jié)合親和力排列，強(qiáng)結(jié)合(strong binding, SB)為%Rank≤0.50，弱結(jié)合(weak binding, WB)為%Rank≤2.0。設(shè)定條件后，輸入抗原蛋白質(zhì)氨基酸序列，得到預(yù)測(cè)結(jié)果。選出標(biāo)有SB和WB的預(yù)測(cè)表位和肽親和力等參數(shù)資料，對(duì)中國(guó)人群常見HLA分型的腫瘤抗原表位，用BLAST軟件進(jìn)行表位位置比對(duì)和分析。

3.2HLA分型供體的選擇與肽的合成 采集志愿者血液測(cè)序(華大基因公司)，用基因分型法(Sequencing Based Typing，SBT)進(jìn)行HLA 分型檢測(cè)。結(jié)合表位預(yù)測(cè)和志愿者HLA預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇含有中國(guó)人群常見的HLA-A*11:01和HLA-B*46:01等位基因的志愿者作為健康血液捐獻(xiàn)者，攜帶HLA-B*46:01的志愿者編號(hào)為D001，攜帶HLA-A*11:01的志愿者編號(hào)為D002。為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的復(fù)雜性，選擇蛋白質(zhì)較小的KK-LC-1表位進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了避免抗原短肽不需要蛋白質(zhì)水解加工直接與MHC分子結(jié)合產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的可能性，模擬細(xì)胞內(nèi)抗原肽處理加工過程，選擇KK-LC-1預(yù)測(cè)結(jié)果中強(qiáng)結(jié)合表位，在預(yù)測(cè)表位的基礎(chǔ)上前后延伸，合成19mer長(zhǎng)肽氨基酸序列。對(duì)最佳實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)肽，合成相對(duì)應(yīng)的表位短肽。肽由上海生工生物工程公司采用固相合成法合成，采用HPLC純化，純度≥90%，產(chǎn)品進(jìn)行ESI質(zhì)譜檢測(cè)，保證序列正確。

3.3免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng) 采集志愿者血液，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。新鮮抗凝血與PBS液1∶1混勻后小心加入與血液等體積的Ficoll細(xì)胞分離液液面上，800×g離心20 min。收集中間的PBMC層，再用PBS混合，以200×g離心10 min，洗滌2次。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)制備與培養(yǎng)：(1)將分離的PBMC用 RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)密度為1.0×107/L，置于6孔板內(nèi)，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h貼壁；洗去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)用RPMI-1640培養(yǎng)液，并添加人GM-CSF(1×106U/L)、人IL-4 (5×105U/L)和10%自體血清，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)3天后半量換液并補(bǔ)足細(xì)胞因子；(3)第6天加入人TNF-α 2.0×105U/L)，IL-1β(1.0×107U/L)和IL-6 (1.0×106U/L)，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；(4)第8天收獲成熟DC(mature DC, mDC)。通過兩步誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)條件，可以在8 d內(nèi)利用1×107個(gè)PBMC獲得1.0×106個(gè)mDC。T 細(xì)胞培養(yǎng)：去除貼壁細(xì)胞剩下的懸浮細(xì)胞用于培養(yǎng)T細(xì)胞，培養(yǎng)液為RPMI-1640、1.0×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L-谷氨酰胺、10%自體血清和3.0×104U/L IL-2，每3天半量換液并補(bǔ)充3.0×104U/L IL-2，每7 d開始新一輪抗原刺激培養(yǎng)。

3.4抗原特異性T細(xì)胞的刺激 DC加載肽體外激活T細(xì)胞以測(cè)試長(zhǎng)肽的反應(yīng)性。第1輪刺激：PBMC置于6孔板中(每孔1.0×107)，培養(yǎng)液為RPMI-1640 + 10%自體血清+2.0×104U/L IL-2，并加入合成的長(zhǎng)肽(5 mg/L)，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，3 d后換液1次并補(bǔ)充細(xì)胞因子。第2輪刺激：用mDC細(xì)胞提呈抗原，將第1輪刺激擴(kuò)增后的T細(xì)胞與mDC以10 ∶1的比例繼續(xù)加肽(5 mg/L)刺激培養(yǎng)，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，3 d后換液1次并補(bǔ)充細(xì)胞因子。第3輪刺激：重復(fù)第2輪的步驟。用經(jīng)過肽-DC刺激3周后的T細(xì)胞檢測(cè)抗原激活的T細(xì)胞反應(yīng)性指標(biāo)(IFN-γ的分泌與CD137上調(diào))，用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)T細(xì)胞產(chǎn)生分泌的IFN-γ，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞CD137的上調(diào)。

3.5酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定 將T細(xì)胞(每孔1.0×105個(gè))與mDC(每孔1.0×104個(gè))置于用IFN-γ單抗預(yù)包被的培養(yǎng)孔中， 用RPMI-1640培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入多肽(5 mg/L)，對(duì)照組孔不加肽，陽(yáng)性對(duì)照孔加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)。每組各重復(fù)1次。檢測(cè)板置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，按試劑盒說明書進(jìn)行顯色檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)條掃描拍照，并進(jìn)行IFN-γ斑點(diǎn)記錄統(tǒng)計(jì)。

3.6流式細(xì)胞檢測(cè) 將T細(xì)胞(每孔1.0×105)與mDC細(xì)胞(每孔1.0×104)置于96孔板中，用RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組加入多肽(5 mg/L)，對(duì)照組孔不加肽。20～24 h后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各重懸細(xì)胞于400 μL的PBS，將細(xì)胞等分成2部分，一部分加入2 μL不同熒光標(biāo)記的CD3、CD4、CD8和CD137抗體，另一部分用同型抗體(isotype)做陰性對(duì)照染色。室溫避光孵育20 min，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，用BD FACS Canto 流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)檢測(cè)染色的細(xì)胞，用同型抗體染色的細(xì)胞設(shè)定各種條件熒光抗體的檢測(cè)參數(shù)(激光電壓等)，設(shè)定條件后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞。用BD FACS Canto軟件和FlowJo軟件分析流式檢測(cè)數(shù)據(jù)，確定CD3+CD4+CD137+以及CD3+CD8+CD137+的T細(xì)胞亞群分布情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0和GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腫瘤抗原表位的預(yù)測(cè)

MAGE-A1、NY-ESO和KK-LC-1抗原與中國(guó)人群中>1%的35個(gè)HLA等位基因結(jié)合的預(yù)測(cè)表位在蛋白質(zhì)序列中的位置分析顯示，抗原表位的位置各有所不同，NY-ESO的表位高度集中在2個(gè)部位，MAGE-A1的表位分布較均勻，KK-LC-1的表位大部分位于蛋白質(zhì)多肽的前部，見圖1。其中針對(duì)中國(guó)人群中>10%的6個(gè)HLA等位基因，MAGE-A1有36肽，NY-ESO有22肽，KK-LC-1有12肽，見表1。上述結(jié)果表明這3個(gè)CTA中含有許多中國(guó)人常見的HLA分型提呈的表位，可以用作T細(xì)胞識(shí)別的靶標(biāo)，其中KK-LC-1蛋白序列最少，位點(diǎn)最易分析，因此選擇KK-LC-1做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.Location of the predicted epitopes of tumor-associated antigens. The predicted epitopes of three TAAs were analyzed with NCBI protein BLAST software to localize the position of epitopes within proteins. The predicted strong binding epitopes restricted by HLA-A/B/C greater than 1%frequency in Chinese population were shown. A: NY-ESO; B: MAGE-A1; C: KK-LC-1.

圖1腫瘤相關(guān)抗原預(yù)測(cè)表位的位置

表1中國(guó)人群中頻率大于10%的HLA所限定的抗原表位個(gè)數(shù)

Table 1.Numbers of the epitopes defined by HLA with a frequency greater than 10% in the Chinese population

HLA allele (frequency)KK-LC-1NY-ESOMAGE-A1A?11:01 (20.9%)1011C?01:02 (15.8%)649A?24:02 (15.5%)116C?07:02 (15.2%)051A?02:01 (12.0%)351B?46:01 (10.3%)178

2 健康志愿者HLA分型與抗原表位的選擇

志愿者D001和D002的HLA分型檢測(cè)結(jié)果顯示,D001攜帶HLA-B*46:01,D002攜帶 HLA-A*11:01，見表2。KK-LC-1抗原表位與中國(guó)人群中>10%的HLA等位基因的分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，5個(gè)常見HLA限定的KK-LC-1強(qiáng)結(jié)合抗原表位有12個(gè)，見表3。根據(jù)表位預(yù)測(cè)與志愿者HLA分型檢測(cè)結(jié)果， 選擇設(shè)計(jì)合成2個(gè)長(zhǎng)肽：與HLA-B*46:01匹配的長(zhǎng)肽氨基酸序列為L(zhǎng)ASSILCALIVFWKYRRFQR；與HLA-A*11:01匹配的長(zhǎng)肽氨基酸序列為L(zhǎng)SRDILNNFPHSIARQKRI。

表2 實(shí)驗(yàn)志愿者PBMCs的HLA分型

表3 KK-LC-1抗原HLA I型強(qiáng)結(jié)合肽表位預(yù)測(cè)

3 KK-LC-1長(zhǎng)肽刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的抗原特異性反應(yīng)

從PBMC中制備抗原提呈功能最強(qiáng)的mDC，光鏡下呈葡萄狀，見圖2A;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示表達(dá)mDC特有的CD83和CD86表面標(biāo)志，見圖2B。用mDC加載抗原長(zhǎng)肽刺激T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組的T細(xì)胞經(jīng)mDC提呈的長(zhǎng)肽刺激后呈現(xiàn)比對(duì)照組更明顯的細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，見圖3。刺激結(jié)果提示長(zhǎng)肽被吞噬加工提呈到細(xì)胞表面，可以刺激抗原特異性T細(xì)胞活化，產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)。

Figure 2.Identification of mDC. A: morphology of mDC under microscope; B: expression of the mDC markers CD83 and CD86 mea-sured by flow cytometry.

圖2成熟DC的形態(tài)和分子標(biāo)志鑒定

Figure 3.Microscopic morphology of the peptide-activated T cells (culture for 3 weeks). A: experimental group, T cells and DC cells were stimulated by peptide; B: control group, T cells and DC cells without peptide.

圖3T細(xì)胞刺激的鏡下形態(tài)

IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,刺激3周后，與只有T細(xì)胞和DC的對(duì)照組對(duì)比，D001加載LSRDIL肽的T細(xì)胞釋放IFN-γ斑點(diǎn)數(shù)顯著增高(P<0.05)，見圖4A； D002加載LASSIL肽的T細(xì)胞釋放IFN-γ斑點(diǎn)數(shù)亦顯著增高(P<0.05)，見圖5A。

對(duì)D001的T細(xì)胞選擇LSRDIL肽刺激后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，加肽的實(shí)驗(yàn)組中CD137陽(yáng)性表達(dá)CD8+T細(xì)胞對(duì)比不加肽的對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，見圖4B，說明經(jīng)抗原刺激后，D001組有針對(duì)LSRDIL肽的特異性CD8+T細(xì)胞。對(duì)D002的T細(xì)胞選擇LASSIL肽刺激后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，加肽的實(shí)驗(yàn)組中CD137陽(yáng)性表達(dá)CD8+T細(xì)胞對(duì)比不加肽的對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，見圖5B，說明經(jīng)抗原刺激后，D002組有針對(duì)LASSIL肽的特異性CD8+T細(xì)胞。

ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示KK-LC-1 2個(gè)長(zhǎng)肽可刺激CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性反應(yīng)，表明長(zhǎng)肽中含有KK-LC-1的HLA I類抗原表位，其中D002組長(zhǎng)肽反應(yīng)效果好，HLA-A*11:01是純合子。因此用LASSIL長(zhǎng)肽預(yù)測(cè)結(jié)合最強(qiáng)的表位合成短肽(序列為L(zhǎng)CALIVFWK)，進(jìn)一步確定抗原表位。

4 KK-LC-1短肽刺激T細(xì)胞抗原特異性反應(yīng)和CD137+ T細(xì)胞的分離

比較D002經(jīng)LASSIL長(zhǎng)肽和LCALIV短肽刺激后T細(xì)胞活化反應(yīng)，IFN-γ ELISPOT結(jié)果顯示： T細(xì)胞不加肽的對(duì)照組沒有明顯激活反應(yīng)；LASSIL長(zhǎng)肽組斑點(diǎn)數(shù)較多； LCALIV短肽組斑點(diǎn)數(shù)顯著增高(P<0.05)，見圖6A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：LCALIV短肽組中CD137陽(yáng)性表達(dá)CD8+T細(xì)胞與LASSIL長(zhǎng)肽組和不加肽組相比均顯著增高(P<0.05)，見圖6B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明短肽比長(zhǎng)肽刺激效果顯著增高，能夠更精確地確定抗原表位。

討 論

腫瘤過繼T細(xì)胞治療的靶標(biāo)為各種腫瘤抗原，確定抗原表位是特異性免疫治療的基礎(chǔ)。CTA在不同種類腫瘤細(xì)胞中均有一定的表達(dá)，在正常組織細(xì)胞中很少或沒有表達(dá)。CTA是理想的抗腫瘤TCR藥物研發(fā)靶標(biāo)[6]， 因此，我們選擇CTA作為研究模型，建立抗原表位實(shí)驗(yàn)鑒定技術(shù)?；诒菊n題組李亮平等研究西方人常見的HLA-A2限定的MAGE-A1和NY-ESO肽的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[7-8]及美國(guó)NIH的Rosenberg實(shí)驗(yàn)室最近關(guān)于KK-LC-1是一個(gè)免疫原性比較強(qiáng)的CTA抗原[9]的報(bào)道，首選NY-ESO、MAGE-A1和KK-LC-1作為研究模型，建立技術(shù)體系。

Figure 4.T-cell activation of D001 stimulated by the 2 long peptides of KK-LC-1. A: production of IFN-γ was measured by ELISPOT assay; B: flow cytometric detection of CD137. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPEP (-) group;##P<0.01vsT+DC group.

圖4D001對(duì)KK-LC-12種長(zhǎng)肽的反應(yīng)

Figure 5.T-cell activation of D002 stimulated by the 2 long peptides of KK-LC-1.A: production of IFN-γ was measured by ELISPOT assay; B: flow cytometric detection of CD137. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPEP (-) group;##P<0.01vsT+DC group.

圖5D002對(duì)KK-LC-12種長(zhǎng)肽的反應(yīng)

Figure 6.T-cell activation of D002 stimulated by LASSIL long peptide and LCALIV short peptide of KK-LC-1.A: production of IFN-γ was measured by ELISPOT assay; B: flow cytometric detection of CD137. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPEP (-) group;##P<0.01vsLASSIL group;△△P<0.01vsT+DC group;▲P<0.05vsT+DC+LASSIL group.

圖6D002對(duì)KK-LC-1LASSIL長(zhǎng)肽和LCALIV短肽的反應(yīng)

傳統(tǒng)的抗原表位鑒定[10-11]涉及復(fù)雜的技術(shù)。首先需要得到抗原反應(yīng)性T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞系；合成完整抗原蛋白質(zhì)，經(jīng)過蛋白水解酶處理，形成大小不等的肽段，經(jīng)過高效液相色譜法分離，用一系列分離的肽刺激T細(xì)胞雜交瘤或T細(xì)胞系產(chǎn)生反應(yīng)，最終確定有刺激作用的肽段序列，即抗原表位。這些實(shí)驗(yàn)耗時(shí)耗力或者需要昂貴的設(shè)備。因此，建立快速有效的抗原表位鑒定技術(shù)顯得十分重要。

隨著HLA分子結(jié)構(gòu)研究的進(jìn)展，建立了以研究西方人常見的HLA-A2為基礎(chǔ)的MHC/肽親和力預(yù)測(cè)技術(shù)。根據(jù)免疫原性肽的氨基酸序列的分布特點(diǎn)，建立了預(yù)測(cè)肽與MHC分子結(jié)合的初步方法[12]。但這些預(yù)測(cè)方法不夠準(zhǔn)確，對(duì)中國(guó)人常見的HLA位點(diǎn)基因更不準(zhǔn)確，難以確定肽/MHC的結(jié)合親和力。

隨著免疫原性肽資料的積累，HLA分子結(jié)構(gòu)的解析精度的提高和計(jì)算機(jī)算法的改進(jìn)，丹麥技術(shù)大學(xué)生物進(jìn)樣器生物序列分析中心的Morten Nielsen課題組建立了一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，改進(jìn)了T細(xì)胞I類表位的預(yù)測(cè)[13]。新方法的性能大大高于其他方法，能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)抗原表位以及肽/MHC的結(jié)合親和力。利用HLA/肽預(yù)測(cè)技術(shù)可以簡(jiǎn)化抗原表位的鑒定。

目前國(guó)際上的研究主要集中在西方人最常見的HLA-A*02:01等位基因上，針對(duì)中國(guó)人群常見HLA分型(如HLA-A*11:01和HLA-B*46:01等)匹配的腫瘤抗原則少有研究。我們針對(duì)中國(guó)人群常見的HLA I類分型，利用這一改進(jìn)的預(yù)測(cè)工具對(duì)常見的CTA進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)，結(jié)果分析表明存在眾多中國(guó)人常見HLA分子限定的抗原表位。

NY-ESO中西方人常見的等位基因HLA-A2限定的表位較多，MAGE-A1的分子量較大，實(shí)驗(yàn)分析相對(duì)復(fù)雜，而KK-LC-1有中國(guó)常見HLA分型(如A*11:01和B*46:01)限定的數(shù)個(gè)表位，易于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此選擇KK-LC-1抗原進(jìn)行后續(xù)深入的驗(yàn)證研究。KK-LC-1是由Fukuyama等[14]于2006年發(fā)現(xiàn)的，陸續(xù)有研究表明KK-LC-1在81%胃癌[15]、53%三陰性乳腺癌[16]、40%轉(zhuǎn)移性宮頸癌和40%非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)[9]，但不在除睪丸外正常的組織中表達(dá)，這表明它可能被T細(xì)胞安全地靶向。

由于腫瘤病人體內(nèi)能引起有效T細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原比例很低，加上免疫功能系統(tǒng)減弱，直接采集病人血液進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)比較困難，因此采用健康人的PBMC進(jìn)行刺激，健康人免疫系統(tǒng)未受腫瘤細(xì)胞的抑制及藥物影響，具有更豐富的T細(xì)胞庫(kù)，篩選到特異性T細(xì)胞的幾率更大。

通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的有效性和可靠性：CD137和IFN-γ的雙陽(yáng)性結(jié)果表明長(zhǎng)肽可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫活化反應(yīng)，T細(xì)胞已被完全激活并開始行使功能，隨即進(jìn)行短肽刺激得到特異性更高的T細(xì)胞并確定精準(zhǔn)抗原表位。預(yù)測(cè)的抗原表位結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相匹配，表明預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，KK-LC-1可以作中國(guó)人群腫瘤特異性免疫療法的新靶標(biāo)。這一研究也為分離克隆腫瘤抗原特異性的TCR提供了基礎(chǔ)，為TCR-T細(xì)胞治療提供了可能性。

由于健康志愿者獻(xiàn)血量有限，得到的特異性T細(xì)胞較少，目前難以直接進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。我們后續(xù)將建立RACE-PCR和單個(gè)T細(xì)胞TCR的基因擴(kuò)增克隆與測(cè)序技術(shù)，以分離抗腫瘤TCR基因，在短時(shí)間里產(chǎn)生大量具有抗癌活性的T細(xì)胞，用于TCR-T細(xì)胞治療研發(fā)。大量抗腫瘤TCR基因的分離與應(yīng)用，將對(duì)腫瘤的T細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域產(chǎn)生重要的影響[17-18]。

綜上所述，本研究建立了快速鑒定腫瘤抗原表位并確定精準(zhǔn)抗原表位的技術(shù)方法，為分離抗癌T細(xì)胞以及相應(yīng)的TCR基因提供了基礎(chǔ)?？焖勹b定技術(shù)的建立與推廣，將有利于推動(dòng)中國(guó)癌癥病人的特異性免疫治療(TCR-T)的開發(fā)與應(yīng)用。